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草鱼补体基因在GCRV感染过程中的表观遗传学调控机制
熊律
Subtype硕士
Thesis Advisor汪亚平
2018
Degree Grantor中国科学院水生生物研究所
Place of Conferral中国科学院水生生物研究所
Abstract

草鱼(Ctenopharyngodon idellus)是我国淡水养殖领域中最为重要的经济鱼类之一,具有重大的经济价值。然而草鱼在养殖过程中极易患病,尤其是草鱼呼肠孤病毒(grass carp revious, GCRV)引起的草鱼出血病,对草鱼养殖产业造成巨大的经济损失。但是,目前GCRV的致病机制仍不清楚。因此,深入研究GCRV的致病机制并由此提出对应的治疗措施,具有十分重要的意义。本实验室前期通过转录组测序(RNA-seq)表明,草鱼补体与凝血级联反应相关基因(以下简称草鱼补体基因)在GCRV感染后第7天显著上调表达,表明草鱼补体通路的强烈激活。然而该通路的强烈激活可能会引起草鱼血细胞、血管内皮细胞的坏死以及血栓细胞的活化,说明草鱼补体基因的激活可能与GCRV引起草鱼出血病的出血症状有关。进一步通过微小RNA测序(miRNA-seq)表明,在GCRV感染后草鱼补体基因的表达受到了非编码RNA中的miRNA调控。表观遗传学包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色体重塑、非编码RNA(non-coding RNA)等,其中DNA甲基化为最常见的表观遗传学修饰。为了进一步研究草鱼补体基因在GCRV感染过程中的表观遗传学调控机制,我们从DNA甲基化的方面着手,研究了草鱼补体基因在GCRV感染后的DNA甲基化水平变化,并与其基因表达水平进行了相关性分析,具体结果如下:1. 将实验草鱼分为两组(每组300尾),实验组平均每尾注射200μL的II型GCRV病毒液,对照组注射等剂量的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline, PBS),并且在注射后第1、3、5、7、9天共计5个时间点各取15尾草鱼,取脾脏组织,分别用于提取DNA和RNA,其中每5尾草鱼的组织样品混合在一起,15尾草鱼共计3个生物学重复。对于取材后剩余的草鱼,进行死亡率统计和症状观察,其中实验组草鱼死亡率为82.8%,并且有明显的出血症状;而对照组草鱼死亡率仅为1.3%,并且无任何出血症状,说明GCRV感染草鱼的有效性。2. 利用实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR, RT-qPCR)的方法,对草鱼中涉及与DNA甲基化水平相关的4种DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases,Dnmts)基因dnmt1、dnmt2、dnmt6、dnmt7,3种10-11转位蛋白(ten-eleven translocation proteins, Tets)基因tet1、tet2、tet3,以及甘氨酸N-甲基转移酶(glycine N-methyltransferase, Gnmt)基因gnmt在GCRV感染后实验组和对照组的基因表达水平进行了研究。结果显示,这些基因在GCRV感染之后均出现了一定程度的上调表达,但是其上调表达的程度和时间点却不尽相同。该结果表明这些草鱼DNA甲基化相关酶基因在GCRV感染后的基因表达水平发生改变。3. 同样也是利用RT-qPCR的方法,对12个草鱼补体基因在GCRV感染后实验组和对照组的基因表达水平进行了研究。结果显示,这12个草鱼补体基因在GCRV感染后实验组均表现出相似的表达模式。具体来讲,这12个草鱼补体基因的表达水平实验组均在GCRV感染后第5天和第7天显著高于对照组,均在GCRV感染后第3天和第9天出现下降,并且均在GCRV感染后第3天均显著低于对照组。这些结果表明草鱼补体基因相似的表达模式可能发挥相同的作用。4. 利用MethylFlash? Global DNA Methylation (5-mC) ELISA Easy Kit,对实验组和对照组在GCRV感染后草鱼脾脏组织的全基因组DNA甲基化水平进行了研究。结果显示,对照组在GCRV感染后全基因组DNA甲基化水平无明显差异,然而实验组在GCRV感染后全基因组DNA甲基化水平出现了明显的变化。具体来讲,实验组在GCRV感染后第1天的5-甲基胞嘧啶(5-methyl cytosine, 5-mC)率与对照组相比无明显差异,但是在GCRV感染后第3天、第5天、第7天、第9天的5-mC率显著高于对照组。这些结果表明在GCRV感染后,草鱼脾脏的全基因组DNA甲基化水平上调,这可能与草鱼DNA甲基化相关酶基因表达水平的改变有关。5. 利用亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite sequencing PCR,BSP),对6个草鱼补体基因在GCRV感染后实验组和对照组的DNA甲基化水平进行了研究。结果显示,草鱼凝血因子II(coagulation factor II, f2)基因、甘露糖结合凝集素(mannose-binding lectin, mbl)基因、补体成分5(complement component 5, c5)基因、玻连蛋白(vitronectin, vtn)基因在GCRV感染后实验组的DNA甲基化水平均保持在92.22%~100%的范围内,与对照组相比无明显差异。然而,草鱼补体成分3(complement component 3, c3)基因和激肽原1(kininogen 1, kng1)基因在GCRV感染后实验组的DNA甲基化水平与对照组相比有明显差异。这些结果表明在GCRV感染后,部分草鱼补体基因的DNA甲基化水平发生改变。6. 利用SPSS(Statistical Product and Service Solutions)软件,对草鱼c3基因、kng1基因在GCRV感染后的基因表达水平(用ΔΔCt表示)与其DNA甲基化水平(用Δ甲基化表示)进行相关性分析。结果显示,草鱼c3基因的ΔΔCt与Δ甲基化之间呈现显著性的正相关关系(r2=0.84,p=0.017);同样,在草鱼kng1基因中也得到了类似的结果(r2=0.95,p=0.010)。然而,高的ΔΔCt值表示低的基因表达水平。因此,该结果表明草鱼c3、kng1在GCRV感染后的基因表达水平与其DNA甲基化水平之间呈负相关性,并且草鱼c3、kng1在GCRV感染后的基因表达水平受到表观遗传学DNA甲基化和miRNA的双调控。关键词:草鱼,草鱼呼肠孤病毒,补体与凝血级联反应相关基因,DNA甲基化,基因表达水平

Language中文
Document Type学位论文
Identifierhttp://ir.ihb.ac.cn/handle/342005/39085
Collection学位论文
Recommended Citation
GB/T 7714
熊律. 草鱼补体基因在GCRV感染过程中的表观遗传学调控机制[D]. 中国科学院水生生物研究所. 中国科学院水生生物研究所,2018.
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