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鲟科类精子冷冻保存的改良及其精子质量评价的研究
席萌丹
Subtype博士
Thesis Advisor危起伟
2018
Degree Grantor中国科学院水生生物研究所
Place of Conferral武汉
Abstract

鲟形目鱼类(Acipenseriformes)分为鲟科(Acipenseridae)、白鲟科(Polyodontidae)和已灭绝的软骨硬鳞科(Chondrosteidae),是一类起源早、具有重要科学研究价值和极高经济价值的稀有物种。1998年,世界所有的鲟鱼种类均被列入《濒危野生动植物物种国际贸易公约》附录Ⅱ。为恢复和保护鲟鱼资源,中外学者正不断地对鲟鱼进行各方面的科学研究。精液的超低温冷冻保存是一种重要的物种保护手段,具有重要的科研和应用价值,能够有效的保存物种的种质资源、解决雌雄成熟不同步的问题以及保护物种的遗传多样性。本文的研究主要围绕改良鲟科类精子的超低温冷冻保存技术和健全其精子质量的评价标准而展开。精液超低温冷冻保存技术中最为关键的步骤是稀释液的配制,稀释液由渗透性抗冻剂和非渗透性基础液组成。先对中华鲟精液冷冻稀释液中的渗透性抗冻剂进行了筛选。对甲醇和DMSO两种抗冻剂进行析因实验设计,分析结果发现甲醇和DMSO之间不存在交互作用,不同浓度的甲醇(1%,10%,20%)在精液的冷冻保存效果上有显著性差异,不同浓度的DMSO(0.5%,5%,10%)在精液的冷冻保存效果上无显著性差异。最后,筛选出10%的甲醇为中华鲟精液超低温冷冻保存稀释液中的抗冻剂。二糖是一种非渗透性的冷冻保护剂。我们研究了非还原性的蔗糖和海藻糖以不同的浓度单独或联合使用在达氏鲟精液超低温冷冻保存中的效果。结果表明两种非还原性二糖在低浓度下混合使用获得了最佳的冷冻保存效果。然后,我们进一步研究加入了还原性糖后,蔗糖(非还原性)、海藻糖(非还原性)和乳糖(还原性)单独或联合使用在达氏鲟、中华鲟、史氏鲟和西伯利亚鲟精液超低温冷冻保存中的效果。结果表明:在中华鲟和达氏鲟中,非还原性且具有特殊保护特性的海藻糖和还原性的乳糖组合使用效果最好;在史氏鲟中,乳糖和海藻糖单独或组合使用都能显著提高精子的冷冻保存效果;在西伯利亚鲟中,各处理组间无显著性差异。所以,非还原性且具有特殊保护特性的海藻糖和还原性的乳糖联合使用(15 mmol/L的海藻糖+15 mmol/L的乳糖)是几个处理组中最适宜于冷冻保存中华鲟和达氏鲟精液的方法,该方法同样适用于史氏鲟但不适用于西伯利亚鲟。热休克蛋白90是细胞在遭遇刺激时产生的一种蛋白质,其表达水平在许多物种中与精子的质量呈正相关。戊四烯酮(GGA)在许多报道中被证明可以诱导热休克蛋白90的表达。精子细胞虽已高度分化,但是转录和翻译都还可以在其中发生。将不同浓度的GGA(0、13.46、67.31、134.61、673.07、1346.13或6730.67μmol/ L)添加到中华鲟精液的冷冻稀释液中研究其对中华鲟精液冷冻保存效果的影响。结果发现在GGA浓度低于673.07μmol/ L时精子质量随着GGA浓度的增加而升高,但是在GGA浓度大于673.07μmol/ L后精子质量随着GGA浓度的增加反而下降。然后,用Western blot方法检测GGA浓度为0(对照组)、673.07 μmol/L(精子质量最好的组)和6730.67 μmol/L(GGA浓度最高的组)时冻精中HSP90α的表达量。结果发现HSP90α的表达量在对照组中最低且随着GGA浓度的增加HSP90α的表达量也不断升高。所以,研究结果表明,GGA能够诱导中华鲟精子中HSP90α表达量的增加,并且在GGA浓度小于等于673.07 μmol/L时这种增加可以提升冻精的质量。这项研究给我们提供了一种可行的技术,即在中华鲟精子的超低温冷冻保存中通过添加GGA诱导HSP90α的表达来提高冻精的质量。通常,在评价精子的质量时,我们是通过精子的活力、精子质膜的完整性百分比以及精子顶体的完整性百分比等质量参数来判断精子质量的好坏。但是,在不同的物种中这些指标的检测方法会有一定的差异。所以,我们在中华鲟中设计实验筛选了适用于检测这些精子质量参数的方法。检测精子活力时比较了计算机辅助精子分析系统(CASA)分析法和传统的显微镜观察法,结果显示计算机辅助精子分析系统(CASA)分析法得到的结果可以更加精确、全面、准确的反映鲟鱼精子的运动状态,我们从计算机辅助精子分析系统(CASA)的检测结果中选取了快速向前运动精子百分比,精子平均曲线运动速度(VCL)、精子平均直线运动速度(VSL)和精子平均路径运动速度(VAP)这四个数据来记录精子活力。对于顶体完整性百分比的检测,比较了考马斯亮蓝染色法和络合异硫氰荧光素的花生凝集素(FITC-PNA)/二脒基苯基吲哚(DAPI)联合染色法的染色效果,结果显示络合异硫氰荧光素的花生凝集素(FITC-PNA)/二脒基苯基吲哚(DAPI)联合染色法能够更加明确、清楚的观察到鲟鱼精子中顶体的存在与否,所以络合异硫氰荧光素的花生凝集素(FITC-PNA)染色法为更优质的顶体染色法。在分析质膜完整性百分比时对比了两种检测方法,一种是低渗肿胀法,另一种是碘化丙啶(PI)染色法,结果显示碘化丙啶(PI)染色法比低渗肿胀法能更加清楚、准确的计数鲟鱼精子质膜的完整性与否为较优的评价质膜完整性百分比的方法。受精率是精子质量的直接反映,所以,同时也对受精率的检测方法进行了研究。然后,在中华鲟精子中,Pearson相关分析的结果表明:受精率与快速向前运动精子百分比、VSL、VAP和质膜完整性百分比之间呈显著性正相关(P=0.025、0.046、0.013、0.046<0.05),受精率与VCL和顶体完整性百分比之间呈极显著性正相关(P=0.001、0.002<0.01)。以上结果说明快速向前运动精子百分比、VCL、VSL、VAP、质膜完整性百分比和顶体完整性百分比这些常规质量参数都可用以评价精子的质量。烯醇化酶3(ENO3)和质膜Ca2 + ATPase亚型(PMCA2)是与精子质量相关的蛋白质。将蔗糖、海藻糖和乳糖单独或者组合使用在中华鲟精液超低温冷冻保存中得到了六个处理组。通过蛋白质印迹法检测每个处理组中ENO3和PMCA2的表达水平。并对每个处理组都检测了反映精子质量的七个参数:快速向前运动精子百分比,VCL,VSL,VAP,精子顶体完整性百分比,精子质膜完整性百分比和受精率。检测了ENO3和PMCA2的表达水平(相对灰度值)后,研究了中华鲟冻精中二糖组成、精子质量和蛋白表达量之间的关系。结果表明,ENO3和PMCA2的表达水平在15 mmol/L 海藻糖 +15 mmol/ L乳糖处理组的中华鲟精液中最高。而且,超低温冷冻保存的中华鲟精子中,ENO3的表达量与质膜完整率百分比呈显著性正相关(P<0.05),PMCA2的表达量与精子运动参数(快速向前运动精子百分比,精子曲线运动速度、精子直线运动速度,精子平均路径运动速度)呈显著性正相关(P<0.05)。因此,我们认为ENO3和PMCA2在中华鲟精液中的表达水平可以作为评价其精子质量的有价值的指标。在精子质量参数中,受精率是精子质量的直接反映,是由多种因素共同作用的结果。因此,设计实验量化了中华鲟精子受精率与其他质量参数(快速向前运动精子百分比、精子曲线运动速度、精子直线运动速度、精子平均路径运动速度、精子顶体完整性百分比和精子质膜完整性百分比)之间的关系,并利用它们之间的关系建立数学模型用以受精率(精子质量)的预测。用50个精子样本做主成分回归分析表明,受精率(Y)与精子其他质量参数(快速向前运动精子百分比—X1、精子曲线运动速度—X2、精子直线运动速度—X3、精子平均路径运动速度—X4、精子顶体完整性百分比—X5、精子质膜完整性百分比—X6)之间的关系可以通过模型方程Y = -23.766 + 0.150*X1 + 0.043 * X2 + 0.019 * X3 + 0.029 * X4 + 0.226 * X5 + 0.055 * X6来计算。用另外五个精液样本,将检测得到的精子质量参数的数据带入以上模型方程计算出受精率,并将其与这五个样本实际所得受精率用Pearson相关进行相关性分析,分析所得相关系数为0.916 (P = 0.029, < 0.05, N = 5),即计算所得受精率和实际受精率之间呈显著性正相关。以上结果表明,所得模型方程可用于有效的预测中华鲟精液的受精率并准确的评估其精子质量。

Language中文
Document Type学位论文
Identifierhttp://ir.ihb.ac.cn/handle/342005/39072
Collection学位论文
Recommended Citation
GB/T 7714
席萌丹. 鲟科类精子冷冻保存的改良及其精子质量评价的研究[D]. 武汉. 中国科学院水生生物研究所,2018.
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