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PEP-CTERM蛋白质对微生物形成菌胶团的影响和作用机理
夏明
Subtype博士
Thesis Advisor邱东茹
2018
Degree Grantor中国科学院水生生物研究所
Abstract活性污泥法广泛应用于城市污水和工业废水的处理已有上百年历史,菌胶团的形成是活性污泥法的关键,许多细菌都被发现可以形成菌胶团,包括动胶菌(Zoogloea)、索氏菌(Thauera)、水居菌(Aquincola)、杜擀氏菌(Duganella) 和硝化螺旋菌(Nitrospira)中的完全氨氧化菌。之前的研究中我们已经分别从解叔丁醇水居菌(Aquincola tertiaricarbonis)RN12和喜树脂动胶菌(Zoogloea resiniphila)MMB两株菌中发现大型胞外多糖合成基因簇参与菌胶团形成,还发现除了多糖合成基因之外还有一种调控因子(sigma54)参与菌胶团形成。然而,是由rpoN基因调控的下游的哪个基因参与菌胶团过程还不得而知,本论文在鉴定和分析下游蛋白及其功能上取得的主要研究结果总结如下: 1、通过mariner转座子插入突变的方法在解叔丁醇水居菌RN12菌株中发现一个翻译为含有重复三角形四肽结构域(TPR)的蛋白的prsT基因,其上游的PEP-CTERM基因pepA(RN12)可以将rpoN1突变株RN12T4中分泌到培养基中的多糖重新包裹菌体,从而使其能够产菌胶团,且pepA(RN12)无法回补rpoN1突变株的生物膜形成和细胞群集运动。在喜树脂动胶菌MMB菌株中直接筛选到PEP-CTERM基因A(命名为pepA)的突变株MMBZM27,其菌胶团形成出现缺陷,并通过遗传回补分析进一步验证了pepA(MMB)的功能,我们进一步构建了pepA(MMB)框内缺失突变株,表型与突变株MMBZM27一样。通过引物延伸、半定量PCR以及实时定量PCR发现pepA(RN12)和pepA(MMB)基因均是由RpoN调控的,说明RpoN通过调控PEP-CTERM蛋白的表达从而使细菌具有形成菌胶团的能力。2、通过Western blot分析发现PepA(RN12)和PepA(MMB)蛋白存在三个条带,且LC-MS/MS分析表明PepA(RN12)中的三个条带以及PepA(MMB)中的下面两个条带均是目的条带。PhoA实验发现PepA(RN12)和PepA(MMB)中均存在N端信号肽,对比PepA(MMB)WT以及PepA(MMB)V256A,P257A,E258A,P259A的蛋白的串联质谱的结果发现PepA(MMB)WT存在C端的切割并且其切割位点初步预测为A262和S263之间。将PepA(MMB)蛋白的V256、 P257、E258和P259位点逐一突变为丙氨酸(Ala或A)之后进行回补实验,发现PepA(MMB)E258A和PepA(MMB)P259A无法回补MMBZM27的不产菌胶团性状且相应的蛋白条带不稳定,说明 E258和P259为该蛋白C端切割的关键作用位点。3、通过流式细胞技术以及免疫荧光技术,发现PepA(MMB)蛋白最终定位于细胞表面。同时,将pepA(MMB)基因在多糖合成突变株MMBΔgt3中表达后无法在细胞表面发现明显的荧光信号,结果表明PepA(MMB)蛋白通过与多糖相互作用从而使细胞絮凝成团,并且PepA-多糖复合物可能定位于细胞表面,且在没有胞外多糖合成的条件下PepA(MMB)蛋白也无法正确定位。4、LC-MS/MS分析结果表明PepA(MMB)中很多的天冬酰胺(Asn或N)位点存在脱氨基作用,首先想到N-linked糖基化作用,通过肽-N-糖苷酶F的作用后发现并无条带大小变化,即没有已知的真核生物中的N-linked糖基化。为了探索这些N位点上存在的修饰方式,将18个N逐一进行突变后发现N190、N198、N228和N229四个位点突变之后的PepA(MMB)蛋白无法回补MMBZM27的不产菌胶团性状,说明在这四个位点上存在参与菌胶团形成的关键修饰作用,但是具体的修饰方式还有待进一步的研究。 综上所述,我们的结果通过分子生物学方法初步阐明了PEP-CTERM蛋白对微生物形成菌胶团的影响和作用机理,并在以动胶菌和水居菌为代表的革兰氏阴性菌中证实了这类蛋白同时存在N端和C端的蛋白切割以及与C端切割相关的重要位点。我们的实验还发现了这类蛋白中存在关键的天冬酰胺位点的翻译后修饰。这些发现为PEP-CTERM蛋白的结构、翻译后修饰、分选途径和功能的研究奠定了基础,为揭示活性污泥微生物菌胶团形成机理和脱氮除磷工艺作用原理提供理论依据,对活性污泥技术的革新、剩余污泥减量和资源化利用等新技术开发具有参考意义。
Language中文
Document Type学位论文
Identifierhttp://ir.ihb.ac.cn/handle/342005/39067
Collection学位论文
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GB/T 7714
夏明. PEP-CTERM蛋白质对微生物形成菌胶团的影响和作用机理[D]. 中国科学院水生生物研究所,2018.
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