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磷脂:二酰甘油酰基转移酶(PDAT)在海洋微拟球藻脂类代谢中的作用研究
杨娟
Subtype博士
Thesis Advisor胡晗华
2018
Degree Grantor中国科学院水生生物研究所
Abstract微拟球藻属的种类光合作用效率高、生长较快、油含量高、易于大规模培养,被认为是最有潜力的工业产油的模式研究藻种。该属大多数种类的基因组序列已经公布,且已建立了成熟的遗传转化体系和RNA干扰、重源重组、CRISPR/Cas9等基因编辑技术。磷脂:二酰甘油酰基转移酶(PDAT)催化以磷脂为酰基供体,二酰甘油(DAG)为酰基受体,合成三酰甘油(TAG)的反应。体外实验显示,多种类型的磷脂均可以作为酰基供体,它还是一个多功能酶,具有降解包括TAG在内的多种脂类物质的脂肪酶活性。然而,PDAT在体内对底物的特异性及对其他脂类代谢的调控尚不清楚。本文以海洋微拟球藻PDAT(nPDAT)基因为对象,利用过量表达、RNA干扰等遗传操作手段,通过亚细胞定位、生长、脂质组和转录组等分析,详细阐述了nPDAT的底物专一性、对TAG及极性脂代谢的调控机理。研究结果如下:1. 在野生型海洋微拟球藻中过量表达nPDAT,随机挑选8个转化子,选取2个nPDAT在转录和蛋白质水平均显著上调的转基因株用于实验。通空气培养条件下,nPDAT过量表达导致藻细胞TAG含量增加17~50%,过量表达藻株生长及总脂含量与野生型相当,相应地极性脂含量减少。脂肪酸组成分析显示过量表达藻株TAG的C20:4增加。根据nPDAT与eGFP融合蛋白质在海洋微拟球藻及异源的三角褐指藻细胞内的荧光信号,显示nPDAT定位于叶绿体内质网膜(cER)。这些结果暗示,过量表达nPDAT促进细胞利用含C20:4脂酰基的磷脂为主合成TAG。2. 通过RNA干扰技术对nPDAT进行敲降,随机挑选10个转化子,选取2个nPDAT在转录水平下调最为显著的突变株npdat-2(33%)和npdat-4(64%)用于实验。通空气培养条件下,nPDAT的下调导致TAG含量减少19~34%,突变株生长及总脂含量不变,但总极性脂含量增加。尤其是磷脂酰甘油(PG)和磷脂酰乙醇胺(PE)含量在突变株中显著增加,磷脂酰胆碱(PC)也有增加的趋势。PG随着培养时间延长,逐渐减少,而PE则显示出增加的趋势。特别地,突变株中含短链脂酰基(C18)的磷脂酰乙醇胺(lcPE)则减少。脂肪酸分析显示,突变株中总脂的C16:0和C16:1含量增加,而C20:4和C20:5含量显著减少;突变株中TAG的脂肪酸相对组成几乎与野生型相同。基于这些结果及野生型海洋微拟球藻PG(脂酰基链以C16:0、C16:1、C20:4和C20:5为主)和PE(脂酰基链以C20:4和C20:5为主)的脂肪酸组成特性,nPDAT在体内可能主要以PG为底物合成TAG,而对PG的专一性也与nPDAT的定位相吻合。3. 转录组分析显示,nPDAT敲降导致CDP乙醇胺:DAG乙醇胺磷酸转移酶(EPT)剧烈上调,脂肪酸从头合成相关酶、脂肪酸延长酶表达下调,主要的二酰甘油酰基转移酶(DGAT)表达不变或下调。因而,nPDAT敲降导致其底物PG和DAG积累,累积的DAG经EPT形成scPE,而新合成的scPE的脂酰链不能进一步编辑形成长链的脂酰基。 4. 由于nPDAT过量表达可以提高藻细胞TAG含量且对生长没有影响,为进一步扩展它的应用,我们在另一模式产油微藻三角褐指藻中过量表达nPDAT,检测其对油脂积累的影响。将nPDAT分别转入野生型三角褐指藻和3-羟基异丁酰-CoA水解酶(HIBCH)过量表达的三角褐指藻(HIBCH过量表达导致异亮氨酸分解的碳流快速流向三羧酸循环,从而导致油脂合成增加)中,结果显示,在三角褐指藻中过量表达nPDAT可促进TAG积累,并导致TAG中C20:5的相对含量显著增加,这为我们利用基因工程手段促进多不饱和脂肪酸流向TAG提供了新的思路。
Language中文
Document Type学位论文
Identifierhttp://ir.ihb.ac.cn/handle/342005/39032
Collection学位论文
Recommended Citation
GB/T 7714
杨娟. 磷脂:二酰甘油酰基转移酶(PDAT)在海洋微拟球藻脂类代谢中的作用研究[D]. 中国科学院水生生物研究所,2018.
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