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斑马鱼NOD样受体和TBK1激酶在天然免疫中的作用及其机制
胡祎玮
Subtype博士
Thesis Advisor昌鸣先
2018
Degree Grantor中国科学院水生生物研究所
Abstract天然免疫反应是脊椎动物抵抗外来微生物、维持机体稳态的重要方式。它主要通过模式识别受体(Pattern recognition receptors,PRRs)识别病原微生物表面的病原相关分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMP),从而激活一系列的下游信号通路,促进杀菌物质和抗病毒蛋白的分泌。其中,I型干扰素(Interferon,IFN)信号通路在天然免疫抵抗病毒入侵的过程中发挥着重要作用。然而过度的干扰素反应也会造成机体损伤,因此它的活性必须受到严格的调控。研究发现,干扰素通路中许多免疫分子的剪接异构体都可以调控干扰素的产生。本文以斑马鱼为研究对象,对天然免疫中的NOD样受体(NOD like receptors,NLRs)家族成员NOD1、NALPL1、NALPL2以及I型干扰素通路中TBK1(TANK-binding kinase 1)激酶剪接异构体的功能进行了探索;这些结果首次揭示了斑马鱼NOD1对胚胎发育和幼鱼存活的影响、斑马鱼NALPL1和NALPL2在抵抗细菌和病毒感染中的作用以及斑马鱼TBK1的剪接异构体在I型干扰素信号通路中的负调控作用及其机制。NOD1作为NLR模式识别受体家族中最具有代表性的成员,在哺乳动物天然免疫和适应性免疫等多个生物学过程中发挥着重要作用;然而NOD1在早期胚胎发育过程中的功能还鲜有报导。本研究通过Cas9/gRNA系统对斑马鱼的NOD1基因进行突变敲除,并筛选得到了纯合子品系。通过研究发现NOD1对于斑马鱼的胚胎孵化和幼鱼存活至关重要。转录组数据分析的结果显示了NOD1参与斑马鱼幼鱼的代谢和免疫系统进程。进一步研究发现,NOD1缺失后CD44a的表达降低;同时PI3K-AKT信号通路受损。在NOD1缺失的斑马鱼中过表达CD44a可以回复受损的PI3K-AKT信号并提高幼鱼的存活;这说明NOD1可以通过调控CD44a介导的PI3K-AKT信号通路影响斑马鱼幼鱼的存活。低等脊椎动物中包含NACHT结构域的基因超过了400个。目前为止,关于它们功能的研究还较少。本研究克隆得到了斑马鱼两个只含有NACHT结构域的基因,根据系统进化分析将其命名为NALPL1和NALPL2。荧光定量检测结果显示,NALPL1和NALPL2在不同发育阶段和不同器官中的表达不同;细菌和病毒感染可以诱导它们的表达上调。同时,过表达NALPL1和NALPL2显著抑制胞内迟缓爱德华菌的增殖和鲤春病毒的复制。这些结果表明,NALPL1和NALPL2在宿主抗菌、抗病毒免疫反应中发挥重要作用。进一步通过基因芯片分析发现,过表达NALPL1和NALPL2并不影响下游信号通路基因的表达,却可以上调NOD1和MDA5受体的表达;这说明在病原感染的过程中,NALPL1和NALPL2可能通过与其它模式识别受体相互作用而发挥功能。TBK1是一个重要的丝氨酸/苏氨酸激酶,它能够与不同的接头分子相互作用并介导IRF3(interferon regulatory factor 3)的磷酸化,从而在干扰素产生的过程中发挥中心调控作用。在哺乳动物中发现TBK1的一个剪接异构体可以负调控病毒引发的IFN-β信号通路;但是鱼类TBK1剪接异构体的相关研究还未见报道。本研究克隆得到了斑马鱼TBK1的两个剪接异构体,分别命名为TBK1_tv1和TBK1_tv2。氨基酸序列分析显示它们都含有不完整的STKc_TBK1结构域;同时TBK1_tv2还缺失了UBL_TBK1_like结构域。荧光素酶的结果显示,过表达这两个剪接异构体可以显著抑制SVCV感染下RIG-I-,MAVS-,TBK1-和IRF3-介导的干扰素启动子的激活。通过荧光定量分析以及抗病毒活性检测发现,TBK1_tv1和TBK1_tv2可以显著抑制MAVS-和TBK1-诱导的干扰素以及抗病毒相关基因的表达;同时降低MAVS-和TBK1-介导的细胞对病毒感染的抵抗能力。进一步的研究发现,TBK1_tv1和TBK1_tv2不仅可以与TBK1和IRF3相互作用;而且竞争性地抑制TBK1与IRF3的结合,进而削弱了TBK1-介导的IRF3的磷酸化。上述结果表明斑马鱼TBK1的剪接异构体通过影响TBK1-IRF3复合物的形成而负调控I型干扰素反应。综上所述,本研究揭示了斑马鱼NOD1在调控PI3K-AKT信号通路以及幼鱼存活中的重要作用、阐明了NOD1在硬骨鱼类早期胚胎发育中的功能。其次,发现了斑马鱼NALPL1和NALPL2在抵抗细菌和病毒感染过程中的重要作用。此外,克隆得到了斑马鱼TBK1的两个剪接异构体,探究了它们在斑马鱼天然免疫反应中的调控作用,并对其可能的分子机制进行了深入探讨。这些研究为鱼类先天免疫的调控机制奠定了重要的理论基础。
Language中文
Document Type学位论文
Identifierhttp://ir.ihb.ac.cn/handle/342005/39027
Collection学位论文
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GB/T 7714
胡祎玮. 斑马鱼NOD样受体和TBK1激酶在天然免疫中的作用及其机制[D]. 中国科学院水生生物研究所,2018.
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