| 泛素化修饰在鞭毛解聚过程中作用机制的研究 | |
| Alternative Title | Functional study of ubiquitination in flagellar disassembly |
| 王启宇 | |
| Subtype | 博士 |
| Thesis Advisor | 黄开耀 |
| 2017-05 | |
| Degree Grantor | 中国科学院水生生物研究所 |
| Abstract | 纤毛/鞭毛是真核生物中突出于细胞表面一类天线样细胞器，具有高度保守9+2或9+0型微管结构，纤毛控制细胞运动，感受细胞外环境。纤毛的结构和功能异常，可引发纤毛相关疾病，如多囊肾、多指症、肥胖等，统称为“纤毛病”。目前已有大量关于纤毛病发生和纤毛形成机制的研究，但关于纤毛解聚的研究相对较少，特别是蛋白翻译后修饰在其中所起的作用还不清楚。鞭毛组装和解聚高度依赖鞭毛内运输机制（Intraflagellar Transport, IFT），鞭毛解聚时，鞭毛内泛素化蛋白增加，且这种现象在反向运输IFT突变体中更为明显，说明泛素化蛋白可能需要反向运输IFT运回至细胞内。但鞭毛解聚过程中泛素化蛋白种类，泛素链构象形式，以及泛素化修饰在鞭毛解聚过程中的具体作用机制还不清楚，本研究利用纤毛研究的模式生物莱茵衣藻为模型，分离正在变短的纤毛，对其进行蛋白质组学分析和生物化学方法验证，旨在探究泛素化修饰在鞭毛解聚过程中的作用机制。我们利用质谱，对IFT正向分子马达温度敏感型突变体fla10细胞中, 正常和变短的鞭毛总蛋白进行泛素化修饰鉴定，共鉴定出20种可能的与鞭毛解聚相关泛素化蛋白及其相应泛素化位点，同时我们还将带有His标签的Ubiquitin在衣藻细胞中表达，然后纯化鞭毛中泛素化蛋白，发现在变短的鞭毛样品中含有di-Gly修饰信息的蛋白2种，分别为Ubiquitin和ɑ-Tubulin，质谱结果还表明ɑ-Tubulin是短鞭毛中主要泛素化底物。另外，质谱结果显示鞭毛解聚时泛素链主要包括K11，K48，K63三种多聚链形式，K63占主导，我们利用生化方法，对短鞭毛中泛素链构象形式进行验证，发现鞭毛解聚时主要存在K48和K63两种泛素链形式，K63占主要组成部分，同时我们还将带有HA标签的Ubiquitin突变形式（K48R，K63R，K48R/K63R）在野生型CC1009藻株中进行表达，利用NaPPi诱导CC1009鞭毛解聚时，泛素链存在K48和K63两种构象形式，且K63占主导。这些结果表明衣藻鞭毛解聚时，鞭毛中泛素链形成机制相同。作为鞭毛中主要泛素化底物ɑ-tubulin，在鞭毛解聚时泛素化程度增加，主要是由K63多聚泛素链标记ɑ-tubulin Lys304所致，当Lys304突变为Arg时，大部分ɑ-tubulin不能被泛素化，说明Lys304是ɑ-tubulin最主要的泛素化位点。鞭毛解聚时，泛素化位点Lys304突变后的ɑ-tubulin与野生型相比，在鞭毛基质和轴丝组分中产生积累，鞭毛解聚速率变慢。这些结果说明当鞭毛解聚时，泛素首先标记轴丝上的ɑ-tubulin，然后从轴丝上解聚下来，最后被送回到细胞体。免疫共沉淀实验表明IFT复合体A中的组分IFT139与泛素化蛋白互作，说明泛素化蛋白被IFT139反向运输回到细胞内。此研究鉴定了鞭毛变短过程中泛素化底物、多聚泛素链形式及相应泛素化蛋白的泛素化位点，证实鞭毛解聚时的泛素化信号是由K63多聚泛素链标记ɑ-tubulin的Lys304位点引起，并由此阐述泛素化修饰在鞭毛解聚过程中可能所起的作用，并证明了泛素化蛋白是由IFT-A复合体中IFT139运输回至细胞内。 |
| Language | 中文 |
| Document Type | 学位论文 |
| Identifier | http://ir.ihb.ac.cn/handle/342005/31160 |
| Collection | 藻类生物学及应用研究中心_学位论文 |
| Recommended Citation GB/T 7714 | 王启宇. 泛素化修饰在鞭毛解聚过程中作用机制的研究[D]. 中国科学院水生生物研究所,2017. |
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| 泛素化修饰在鞭毛解聚过程中作用机制的研究（7685KB） | 学位论文 | 限制开放 | CC BY-NC-SA | Application Full Text | ||
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