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泛素化修饰在鞭毛解聚过程中作用机制的研究
Alternative TitleFunctional study of ubiquitination in flagellar disassembly
王启宇
Subtype博士
Thesis Advisor黄开耀
2017-05
Degree Grantor中国科学院水生生物研究所
Abstract纤毛/鞭毛是真核生物中突出于细胞表面一类天线样细胞器,具有高度保守9+2或9+0型微管结构,纤毛控制细胞运动,感受细胞外环境。纤毛的结构和功能异常,可引发纤毛相关疾病,如多囊肾、多指症、肥胖等,统称为“纤毛病”。目前已有大量关于纤毛病发生和纤毛形成机制的研究,但关于纤毛解聚的研究相对较少,特别是蛋白翻译后修饰在其中所起的作用还不清楚。鞭毛组装和解聚高度依赖鞭毛内运输机制(Intraflagellar Transport, IFT),鞭毛解聚时,鞭毛内泛素化蛋白增加,且这种现象在反向运输IFT突变体中更为明显,说明泛素化蛋白可能需要反向运输IFT运回至细胞内。但鞭毛解聚过程中泛素化蛋白种类,泛素链构象形式,以及泛素化修饰在鞭毛解聚过程中的具体作用机制还不清楚,本研究利用纤毛研究的模式生物莱茵衣藻为模型,分离正在变短的纤毛,对其进行蛋白质组学分析和生物化学方法验证,旨在探究泛素化修饰在鞭毛解聚过程中的作用机制。我们利用质谱,对IFT正向分子马达温度敏感型突变体fla10细胞中, 正常和变短的鞭毛总蛋白进行泛素化修饰鉴定,共鉴定出20种可能的与鞭毛解聚相关泛素化蛋白及其相应泛素化位点,同时我们还将带有His标签的Ubiquitin在衣藻细胞中表达,然后纯化鞭毛中泛素化蛋白,发现在变短的鞭毛样品中含有di-Gly修饰信息的蛋白2种,分别为Ubiquitin和ɑ-Tubulin,质谱结果还表明ɑ-Tubulin是短鞭毛中主要泛素化底物。另外,质谱结果显示鞭毛解聚时泛素链主要包括K11,K48,K63三种多聚链形式,K63占主导,我们利用生化方法,对短鞭毛中泛素链构象形式进行验证,发现鞭毛解聚时主要存在K48和K63两种泛素链形式,K63占主要组成部分,同时我们还将带有HA标签的Ubiquitin突变形式(K48R,K63R,K48R/K63R)在野生型CC1009藻株中进行表达,利用NaPPi诱导CC1009鞭毛解聚时,泛素链存在K48和K63两种构象形式,且K63占主导。这些结果表明衣藻鞭毛解聚时,鞭毛中泛素链形成机制相同。作为鞭毛中主要泛素化底物ɑ-tubulin,在鞭毛解聚时泛素化程度增加,主要是由K63多聚泛素链标记ɑ-tubulin Lys304所致,当Lys304突变为Arg时,大部分ɑ-tubulin不能被泛素化,说明Lys304是ɑ-tubulin最主要的泛素化位点。鞭毛解聚时,泛素化位点Lys304突变后的ɑ-tubulin与野生型相比,在鞭毛基质和轴丝组分中产生积累,鞭毛解聚速率变慢。这些结果说明当鞭毛解聚时,泛素首先标记轴丝上的ɑ-tubulin,然后从轴丝上解聚下来,最后被送回到细胞体。免疫共沉淀实验表明IFT复合体A中的组分IFT139与泛素化蛋白互作,说明泛素化蛋白被IFT139反向运输回到细胞内。此研究鉴定了鞭毛变短过程中泛素化底物、多聚泛素链形式及相应泛素化蛋白的泛素化位点,证实鞭毛解聚时的泛素化信号是由K63多聚泛素链标记ɑ-tubulin的Lys304位点引起,并由此阐述泛素化修饰在鞭毛解聚过程中可能所起的作用,并证明了泛素化蛋白是由IFT-A复合体中IFT139运输回至细胞内。
Language中文
Document Type学位论文
Identifierhttp://ir.ihb.ac.cn/handle/342005/31160
Collection藻类生物学及应用研究中心_学位论文
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GB/T 7714
王启宇. 泛素化修饰在鞭毛解聚过程中作用机制的研究[D]. 中国科学院水生生物研究所,2017.
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