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湖北浠水自来水厂黑褐色絮状物微生物群落分析及Aquincola tertiaricarbonis RN12菌胶团形成机制研究
余佃贞
Subtype博士
Thesis Advisor邱东茹
2017-05
Degree Grantor中国科学院水生生物研究所
Place of Conferral中国科学院水生生物研究所
Abstract2007年以来湖北省浠水县自来水厂井水和末梢水出现大量黑褐色絮状物,此类物质在取水井和供水网内大量存在,严重影响水质。黑褐色絮状物的出现给市民用水造成困扰,成为必须解决的重大民生问题。我们采用常规分离培养方法和分子生物学技术结合的方式研究井水、自来水和黑褐色絮状物等3样品微生物群落组成。另外通过分离培养得到一株菌胶团形成菌株Aquincola tertiaricarbonis RN12,菌胶团形成菌在活性污泥中具有非常关键作用。然而关于Aquincola属细菌形成菌胶团机制目前还没有人报道。因此,本文在对A. tertiaricarbonis RN12菌株进行全基因组测序及注释的基础上,利用mariner转座子插入突变和遗传回补分析来筛选鉴定菌胶团形成相关基因。并探讨了sigma因子RpoN调控菌胶团形成机制。主要研究内容和结果如下:1.通过常规分离培养手段和构建16S rDNA文库技术分析井水、管网水和黑褐色絮状物微生物组成发现:主要微生物群落由Proteobacteria,Bacteroidetes,Deinococcus-Thermus,Firmicutes,Nitrospirae,Planctomycete,Actinobacteria,Acidobacteria和Verrucomicrobia组成,其中假单胞菌属(Pseudomonas)是最大优势菌群。但未能发现Leptothrix属以及其他经常引起自来水管道腐蚀的菌群。Undibacterium属可能是黑褐色絮状物主要优势属细菌,但通过分离培养的方法未能培养得到纯菌加以进一步研究。通过对微生物群落分析和分离培养结果,我们鉴定出一株菌胶团形成菌株A. tertiaricarbonis RN12,该菌具有氧化铁锰等金属物质,可能在黑褐色絮状物形成过程中发挥重要作用。2.通过全基因组测序、拼接及在线注释工具RAST(Rapid Annotation using Subsystem Technology)对拼接后的A. tertiaricarbonis RN12菌株基因组进行注释,结果显示菌株RN12基因组长度7,064,607 bp,GC含量69.3%,共有6324个编码基因,49个RNA。根据注释结果和16S rDNA序列比对,该菌与Rubrivivax和Leptothrix有较高相似性。另外在基因组中还发现有细菌叶绿素色素合成的相关基因簇bchFNBL和光合作用调控基因ppsR和ppaA,以及araC调控子和liuABCDE操纵子。而且该菌基因组中有4个rpoN旁系同源基因。3.通过mariner转座子插入突变的方法,获得了一系列不产菌胶团的突变菌株,破坏的大部分基因都集中在43 kb大小的胞外多糖(extracellular polysaccharides,简称EPS)合成基因簇上,通过遗传回补验证了这些基因参与菌株RN12菌胶团形成。说明菌胶团形成与EPS合成相关。4.我们在这些不产絮突变菌株中,鉴定到4株rpoN1插入突变株,并通过遗传回补加以验证。通过对野生型菌株、rpoN1突变株以及遗传回补菌株的EPS定性和定量分析,发现rpoN1突变株有大量的EPS (soluble EPS,S-EPS)分泌到培养基中,而包裹菌体的EPS (bound EPS, B-EPS)大量减少,但几种菌的总EPS量没明显变化。通过GC-MS和FT-IR光谱分析了B-EPS和S-EPS单糖组分和化学基团基本一致,说明了S-EPS来源于B-EPS。另外通过提取野生型菌株B-EPS发现很难被提取下来。而且,通过转录起始位点鉴定、RT-PCR和定量PCR分析发现RpoN1并不影响胞外多糖合成相关基因的转录。以上结果说明RpoN1所调控的下游基因表达后通过某种未知机制使胞外多糖链之间紧密地结合在细菌细胞群体的表面以形成菌胶团,而不是直接调控EPS的合成。我们还发现RpoN1调控菌株RN12的生物被膜形成和细胞群集运动,并调控与细菌运动相关的功能基因tapA转录表达。而且过量表达这3 rpoN旁系同源基因我们得出了RpoN1调控菌株RN12的菌胶团形成,其他3 rpoN同源基因能部分回补该菌株的细胞运动功能如群集运动,尤其是rpoN2。这4个RpoN功能上交叉但不互补,RpoN1是该菌株的主要σ54因子。综上所述,我们不仅对浠水自来水厂黑褐色絮状物微生物群落进行了分析,为防治此类微生物污染提供科学依据。而且对菌胶团形成菌株RN12进行了全基因组测序和注释,并在此基础上通过分子遗传学分析,鉴定了与菌株RN12菌胶团形成相关的EPS合成相关基因和一个关键调控因子,即RpoN sigma因子。我们的结果可以为揭示细菌菌胶团形成机制打下基础。
Language中文
Document Type学位论文
Identifierhttp://ir.ihb.ac.cn/handle/342005/31127
Collection水环境工程研究中心_学位论文
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GB/T 7714
余佃贞. 湖北浠水自来水厂黑褐色絮状物微生物群落分析及Aquincola tertiaricarbonis RN12菌胶团形成机制研究[D]. 中国科学院水生生物研究所. 中国科学院水生生物研究所,2017.
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