| GnRH在黄鳝和斑马鱼性别分化中的功能研究 | |
| Alternative Title | The functional study of GnRH on sex differentiationin rice field eel and zebrafish |
| 冯 科 | |
| Subtype | 博士 |
| Thesis Advisor | 胡炜 |
| 2017-05 | |
| Degree Grantor | 中国科学院水生生物研究所 |
| Abstract | 促性腺激素释放激素（Gonadotropin-releasing hormone, GnRH）是下丘脑-垂体-性腺（hypothalamic-pituitary-gonad, HPG）轴中的一个重要调控因子，在脊椎动物性腺发育成熟及繁殖中发挥重要作用。黄鳝是一种雌性先熟性逆转鱼类，关于性逆转的机制研究一直是鱼类生殖发育领域的重要科学问题。斑马鱼是一种重要模式生物，在性别分化时期，其性腺最初均为“卵巢样”组织，然后部分个体逐步向精巢方向分化，故其可被认为是一种幼龄雌性同体、雌性先熟的鱼类。本研究以此两种鱼类为研究对象，初步探讨了GnRH在鱼类性别分化中的功能。研究内容主要涉及以下四个方面：1. 在黄鳝中建立高效的TALENs基因编辑技术平台为深入开展黄鳝基因功能研究，本研究首次在黄鳝中建立了胚胎显微注射及TALENs基因编辑技术平台，并对黄鳝性别分化相关基因Dmrt1、Cyp19a1a和Foxl2成功进行了基因编辑，初步研究了其在黄鳝性腺分化中的作用。当在100 ng/μL时，黄鳝胚胎具有较高的成活率（55.26%）和突变效率（69.56%）。采用三引物PCR方法检测黄鳝胚胎的突变效率，发现3种基因的突变效率均在50%以上，表明TALENs在黄鳝中也可以进行高效的基因编辑。黄鳝Dmrt1基因敲除后，3月龄幼鱼性腺Dmrt1和Sox9a1的表达量显著降低，而Cyp19a1a和Foxl2的表达量无显著变化，血清E2、T和11-KT的含量也未受显著影响；Cyp19a1a基因敲除后，Cyp19a1a和Foxl2的表达量降低，而Dmrt1和Sox9a1的表达量无显著变化，血清E2含量显著减少，而T和11-KT的含量并无显著变化；Foxl2基因敲除后，Cyp19a1a和Foxl2的表达量降低，Dmrt1的表达量显著增加，血清E2的含量显著降低，T和11-KT的含量显著升高。结果表明，Foxl2可能在黄鳝早期卵巢分化发育以及性逆转中发挥着重要的作用。2. 黄鳝三种GnRH的克隆与表达分析通过5′RACE获得黄鳝GnRH3的5′UTR序列，长度为332 bp。与NBCI上公布的黄鳝GnRH3序列相比，发现公布的序列实际上为包含第一内含子的一个转录本。进一步克隆获得黄鳝三种GnRH的基因组序列。GnRH1基因长度为703 bp，四个外显子的长度分别为：60，136，99，84 bp；三个内含子的长度分别为：114，102，108 bp。GnRH2基因长度为1987 bp，四个外显子的长度分别为：134，163，84，221 bp；三个内含子的长度分别为：479，100，806 bp。GnRH3基因长度为1511 bp，四个外显子的长度分别为：322，148，81，239 bp；三个内含子的长度分别为：159，205，357 bp。序列相似性比较显示，黄鳝GnRH1与褐石斑鱼的相似度最高，为67%；GnRH2与斜带石斑鱼、尼罗罗非鱼和大黄鱼的相似度最高，均为86.7%；GnRH3同金头鲷和黑鲷的相似度最高，均为87.8%，说明GnRH在不同物种中的保守性较高。系统进化树结果表明，黄鳝三种GnRH分别处于不同的分支中。组织表达结果显示，三种GnRH在脑区中表达量较高，其它外周组织中表达量较低。在黄鳝早期胚胎发育过程中，三种GnRH在出膜之前的表达量均较低，出膜之后表达量显著增加。黄鳝性逆转过程中，性腺GnRH1和GnRH3的表达量在性逆转初期显著增加，随后表达量下降；GnRH2的表达量在卵巢及间性初期表达量均较低，而在间性后期和精巢中显著提高。所以，GnRH可能参与黄鳝性逆转的调控过程中，其中GnRH1和GnRH3可能在性逆转初期发挥作用，而GnRH2可能在精巢发育的维持中发挥功能。1. 黄鳝GnRH2新转录本的发现及功能研究在黄鳝性腺中扩增获得一种包含有第二内含子的新转录本—GnRH2-nv，其蛋白翻译将会提前终止，编码60个氨基酸的蛋白质，包含有21个氨基酸的信号肽，GnRH2核心十肽，以及一种新的GAP2多肽—New GAP2。GnRH2-nv只在性腺中表达，而其它组织中检测不到。在性逆转的过程中，GnRH2-nv在卵巢中表达量较低，而在间性性腺和精巢中一直处于较高水平，暗示其可能在性逆转过程有关。三种多肽GAP2、New GAP2和GnRHa分别体外孵育黄鳝卵巢6 h后，amh的表达量均显著高于对照组；而只有New GAP2可以显著提高sox9a1的表达。体内注射结果表明，注射GAP2后，6 h后amh和foxl2的表达量显著增加，随后表达量下降；cyp19a1a的表达量只是在24 h时显著增加，其它时间点未变。注射New GAP2后，6 h后amh的表达量显著增加，而且维持在较高水平；注射后48 h时，dmrt1a的表达量才显著增加；sox9a1在注射后6 h时显著增加，约是初始时期的5倍，随后表达量恢复至初始水平。注射GnRHa后，雌雄性别分化相关基因的表达量均增加。注射GAP2后，血清T和11-KT的含量显著增加，而血清E2的含量无显著变化；注射New GAP2后的48 h内，血清E2和T的含量无显著变化，而11-KT在注射后12 h时显著增加，随后恢复至初始水平；注射GnRHa后，血清E2和T的含量在12 h和24 h时显著增加，48 h恢复至初始水平，而血清11-KT的含量无显著变化。2. 斑马鱼GnRH3敲除对其生殖能力及胚胎早期PGC生成的影响采用CRISPR/Cas9技术，敲除斑马鱼GnRH3基因，获得缺失8 bp的纯合突变体。为验证GnRH3是否被成功敲除，表达了GnRH3融合蛋白，进而制备了多克隆抗体。采用全胚胎免疫荧光方法，在斑马鱼GnRH3纯合子中检测不到信号，说明GnRH3蛋白被破坏。GnRH3纯合子雌鱼垂体gtha和lhb的表达量显著降低，而fshb的表达量无显著变化；雄鱼垂体三种基因的表达量均无显著变化。雌性GnRH3纯合子的血清E2含量下降，但差异不显著；11-KT的含量无显著变化。雄鱼血清E2和11-KT的含量显著降低。GnRH3敲除后，雌鱼的受精率降低，但GSI和产卵量无显著变化；雄鱼的GSI和受精率也无显著变化。GnRH3突变群体中，雄性的平均比例为70.57%，而野生型为44.32%，表明GnRH3突变导致雄性比例增加。GnRH3敲除后，PGC数量在sphere时期之前无显著变化，但随后显著低于野生型。PGC的分子标记基因vasa和nanos3的表达量也显著降低。注射GFP-nanos1 3′UTR标记早期PGC，进一步采用TUNEL检测PGC的凋亡，GnRH3敲除并未导致PGC凋亡的增加，表明PGC数量的减少可能是由于PGC的增殖受到抑制。GnRH3敲除后，斑马鱼性别分化早期阶段的12 dpf、15 dpf和18 dpf时期，雄性性腺体细胞分化因子sox9a、amh和cyp11b的表达量增加，雌性性腺体细胞分化因子cyp19a1a的表达量下降，说明GnRH3可能通过影响PGC的数量，进一步调控性腺体细胞相关基因的表达来影响斑马鱼早期性别分化。 |
| Language | 中文 |
| Document Type | 学位论文 |
| Identifier | http://ir.ihb.ac.cn/handle/342005/31111 |
| Collection | 鱼类生物学及渔业生物技术研究中心_学位论文 |
| Recommended Citation GB/T 7714 | 冯 科. GnRH在黄鳝和斑马鱼性别分化中的功能研究[D]. 中国科学院水生生物研究所,2017. |
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