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脊椎动物附肢再生能力演化的遗传机制
Alternative TitleThe Genetic Basis of Evolution in Vertebrate Limb Regeneration
陆苏祥
Subtype博士
Thesis Advisor何舜平
2017-06
Degree Grantor中国科学院水生生物研究所
Abstract我国肢体残疾人口约2400万人,约占全国残疾人口总数的四分之一。因此附肢再生研究不仅是再生生物学与再生医学研究者长期聚焦的科学问题,也具有显著的现实意义。然而在脊椎动物中,除了多鳍鱼、肺鱼和蝾螈三大类群,包括哺乳类在内的其它物种类群都不具有内骨胳附肢再生的能力。附肢再生能力在一些类群中是为何/如何获得的,而在另一些类群中是为何/如何丢失的,至今仍然是不清楚的。脊椎动物附肢再生能力的起源、维持与丢失,涉及到多方面的复杂因素,而遗传机制是其中的内在原因。已有的研究表明成年塞内加尔多鳍鱼附肢具有类似四足类附肢的内骨胳结构,并且具有与蝾螈相似的再生过程,能够完成精确的再生。已有的研究也表明多鳍鱼位于辐鳍鱼类基部的系统发育位置,使其成为研究附肢再生能力演化的理想模型。结合已有的相关研究,本研究选择塞内加尔多鳍鱼为主要研究对象,旨在构建脊椎动物附肢演化的研究平台,并探讨附肢再生能力起源、维持与丢失的遗传机制,同时为多鳍鱼成为再生医学研究模型奠定基础。因此,本论文的研究工作主要分为三个部分:(一)为了确定附肢再生相关的关键候选,并为后续的演化分析提供高质量的数据基础,我们使用同位素标记定量蛋白质组技术(iTRAQ),结合塞内加尔多鳍鱼基因组作为背景数据,获得了塞内加尔多鳍鱼附肢再生三个时间点的定量蛋白质组。其中共鉴定到3177个蛋白质和15091个特异肽段。其中共有1006个非冗余差异表达蛋白。使用Cluster、BLAST2GO与PANTHER软件进行差异表达蛋白的聚类分析和功能注释分析,结果表明在塞内加尔多鳍鱼全肢再生过程中的差异表达蛋白主要参与了神经退化、细胞凋亡、细胞生长、干细胞转移与分化、细胞外基质降解与重塑等重要过程。使用Ensembl数据库和R软件,分析了内含子长度分布与附肢再生能力之间的关系,结果发现塞内加尔多鳍鱼的内含子长度在脊椎动物(不包括蝾螈类群)当中处于中间位置,说明巨大的内含子分布并不是附肢再生能力的必要条件。本研究还发现整联蛋白和神经信号可能在附肢再生过程中发挥了重要作用;多鳍鱼附肢再生过程中的基因表达具有高度动态性。(二)为了研究附肢再生能力的维持与丢失的遗传机制,探讨在演化历程中可能受到的选择压力,我们利用得到的蛋白质组数据,结合多鳍鱼、鲨鱼、非洲爪蟾、拉丁迈鱼与六个羊膜类代表物种的基因组数据,以及东美螈的转录组数据,进行了正向选择分析和基因丢失分析。使用PAML软件进行了正向选择分析,结果共在塞内加尔多鳍鱼当中鉴定到了8个正向选择基因(PSGs),功能分析表明,P4HB,RasGrf1,Snap91,DAZAP1,ATXN2和ANK3的功能均涉及细胞分化,增殖和迁移。而MYOF(myoferlin)在膜修复与再生方面发挥作用,DNMT1在肌肉再生方面发挥作用。其中MYOF和P4HB在蛋白质组数据中有显著差异表达,并且突变位点出现在功能结构域当中,表明与附肢再生能力相关的基因受到了选择压力的影响,暗示多鳍鱼附肢再生能力的维持受到了选择压力。使用BLAST软件对羊膜类动物基因组进行了附肢再生相关基因的丢失分析,结果共鉴定到68个羊膜类共同丢失的再生相关祖先基因,包括聚类于DNA结合功能与钙离子结合功能的基因等,也包括推定的DAG1和VIM等重要基因。使用PPI数据库构建蛋白质相互作用网络对丢失基因的重要性进行评估,结果发现ACADVL和lcp1在与整联蛋白相关的网络簇中丢失,暗示这种丢失可能是由选择压力造成的。(三)为了深入研究脊椎动物附肢再生能力起源的原因,我们结合前人的研究,从病理表型、转录组表达谱、关键分子表达调控模式三个方面对多鳍鱼附肢再生的特征进行了采集,并将其对其余两大类群(肺鱼与蝾螈)分别进行了比较。对塞内加尔多鳍鱼附肢再生过程的HE切片、BRDU染色切片、TUNEL染色切片的分析结果表明,多鳍鱼肉鳍结构与辐鳍结构都在第一天时间点形成了伤口表皮(WE),在第四天时间点形成了明显的芽基组织;细胞增殖从第一天到第四天呈现逐渐增加的趋势并且呈现由外向内的趋势;细胞凋亡主要发生于第一天时间点,随着再生进程的发展而逐渐减少,在第四天芽基形成时基本消失。与前人在肺鱼与蝾螈中的研究结果比较之后,发现三大类群的附肢再生过程在细胞形态步骤上是一致的。这种一致性支持脊椎动物附肢再生能力有共同起源的假说。我们将芽基组织与原始组织转录组中的差异表达基因进行注释和富集分析后发现,多鳍鱼肉鳍再生过程中的差异表达基因主要富集于肌肉功能,细胞外基质ECM,形态发生和细胞周期相关的聚类中,这与肺鱼、蝾螈中的情况基本一致。另外,关键分子群的表达调控一致性分析得到的皮尔森相关系数为0.69(多鳍鱼肉鳍与肺鱼肉鳍之间)、0.56(多鳍鱼肉鳍与蝾螈四肢之间),MLP的早期表达调控模式也表现出高度的一致性,表明三大类群的内骨胳附肢再生过程共享一个基因核心程序,支持脊椎动物附肢再生能力有共同起源的假说。辐鳍再生核心程序可能是来自其中一个子集。多鳍鱼辐鳍与三大类群内骨胳附肢再生过程基因表达调控的不一致可能是由于辐鳍本身的异质性(不含有肌肉、神经与内骨胳)导致的,这也表明了辐鳍类附肢再生研究模型(包括斑马鱼)的局限性。这同时也表明,兼具肉鳍结构与辐鳍结构的多鳍鱼模型在附肢再生研究中更具有优势。
Language中文
Document Type学位论文
Identifierhttp://ir.ihb.ac.cn/handle/342005/31074
Collection水生生物多样性与资源保护研究中心_学位论文
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GB/T 7714
陆苏祥. 脊椎动物附肢再生能力演化的遗传机制[D]. 中国科学院水生生物研究所,2017.
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