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鳜的两种抗菌肽和白介素-8 基因的克隆及功能研究
Alternative TitleCloning and functional analysis of two antimicrobialpeptides and interleukin-8 in mandarin fish(Siniperca chuatsi)
王改玲
Subtype博士
Thesis Advisor聂品
2010-11
Degree Grantor中国科学院水生生物研究所
Keyword β 防御素 Hepcidin 白介素-8 基因克隆 组织表达 功能分析
Abstract鳜(Siniperca chuatsi)是我国重要的淡水经济养殖鱼类之一,对其先天免疫系 统相关分子的研究在理论和应用方面均具有重要的意义。本研究克隆了鳜两种抗 菌肽基因,β 防御素(β-defensin)和hepcidin,以及CXC 型趋化因子白介素-8 基因 (interleukin-8, IL-8),对基因的表达特性进行了分析,并对β 防御素和白介素-8 的功能进行了研究。 通过RT-PCR 和RACE-PCR 技术获得了鳜β 防御素、hepcidin 和白介素-8 的cDNA 全长,并采用Genome Walking 的方法获得了三个基因的基因组序列和 β 防御素的启动子区域,分析了三个基因的基因组结构。利用原核和真核表达技 术获得了β 防御素和IL-8 的重组蛋白,分别研究了其抑菌活性和趋化活性。 鳜β 防御素(Siniperca chuatsi β-defensin, ScBD)基因组全长1197 bp,包含三 个外显子和两个内含子,开放阅读框包含192 bp,编码63 个氨基酸,由20 个氨 基酸的信号肽和43 个氨基酸的成熟肽组成。启动子区域包含与抗细菌和抗病毒 转录调控相关的转录因子结合位点,如:NF-κB、Sp1、C/EBP-β和IRF-1 等。健 康鳜的ScBD mRNA 在各个组织中呈组成型表达,并且主要表达于脾脏,LPS 刺 激之后在肝脏、鳃、肠、脾脏和肌肉(含皮肤)中呈上调表达,在肌肉(含皮肤)中 表达量最高。利用原核表达的ScBD 重组蛋白制备的鼠多克隆抗体,经Western Blot 技术检测到ScBD 蛋白表达于脾脏、头肾和鳃中。原位杂交技术检测到ScBD 阳性细胞主要分布于脾脏组织血管周围的黑色素巨噬细胞中心内,头肾组织的小 血管内。真核重组表达质粒pcDNA3.1-ScBD 转染HEK 293T 细胞,分泌表达的 蛋白对大肠杆菌M15 有抑菌作用。 鳜hepcidin 基因组全长980 bp,包含三个外显子和两个内含子,开放阅读框 包含261 bp,编码86 个氨基酸,由信号肽、前导肽和成熟肽组成。鳜hepcidin mRNA 在健康组织内呈组成型表达,并且在肝脏中的表达量最高,在LPS 刺激 之后的肠和鳃组织中呈上调表达。 鳜IL-8 基因组全长1164 bp,包含四个外显子和三个内含子,开放阅读框包 含300 bp,编码99 个氨基酸,含有22 个氨基酸的信号肽和77 个氨基酸的成熟 肽。鳜IL-8 前两个半胱氨酸形成典型的CXC 型结构,在第一个半胱氨酸上游有ELR 特征基序。IL-8 mRNA 在健康鳜的头肾中表达量最高,在LPS 刺激后的 头肾、鳃和脾脏中呈上调表达。原核表达的鳜IL-8 重组蛋白在浓度为15 ng/mL 时对头肾白细胞具有明显的趋化作用,主要趋化淋巴细胞。IL-8 重组蛋白在浓度 为1500 ng/mL 时可以诱导促炎因子IL-1β 和TNFα 表达。
Pages122
Language中文
Document Type学位论文
Identifierhttp://ir.ihb.ac.cn/handle/342005/12948
Collection鱼类生物学及渔业生物技术研究中心_学位论文
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GB/T 7714
王改玲. 鳜的两种抗菌肽和白介素-8 基因的克隆及功能研究[D]. 中国科学院水生生物研究所,2010.
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