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人工合成草鱼生长激素cDNA在大肠杆菌和酵母系统中的表达
王伟
Subtype博士
Thesis Advisor朱作言 ; 梁爱华
2001
Degree Grantor中国科学院水生生物研究所
Place of Conferral中国科学院水生生物研究所
Degree Discipline遗传学
Keyword草鱼生长激素 克隆 表达 发酵 促生长
Abstract生长激素是鱼体正常生长、发育必不可少的内分泌激素,外源生长激素的补偿可以加速鱼体生长,生长激素通过注射、浸泡、投喂作用于鱼体,显著促进了鱼体的生长,提高了饵料的转化效率。鱼类集约化、工厂式养殖对优良产品种和高效饵料提出更高的要求,转生长激素基因鱼通过重组生长激素基因的“内源性”表达,显著地提高了鱼体的生长,重组生长激素基因工程菌“外源性”表达的生长激素蛋白,作为饵料添加剂同样促进了鱼体的生长。鱼类生长激素产业化生产有两个前提,一是重组生长激素基因表达效率的提高,二是表达系统的宿主菌可直接用于饵料。本研究就此两方面进行了探索,主要研究内容如下:1.依据克隆的草鱼生长激素基因和大肠杆菌、酵母偏爱密码子,人工合成草鱼生长激素 cDNA,并在克隆载体 pGEM中克隆。2.构建了四种不同的重组草鱼生长激素原核表达载体:pET-28-GH、pExSecls-GH、pGEX-2T-GH 、pExSecl-GH,分别在大肠杆菌中诱导高效表达,不同的表达载体在宿主大肠杆菌中表达的重组草鱼生长激素蛋白全部以包涵体形式存在。重组草鱼生长激素包涵体复性后,获得具有生物学功能的草鱼生长激素。3.通过亲和层析,纯化了融合有6个组氨酸的草鱼生长激素蛋白。免疫大耳白兔,获得了草鱼生长激素的多克隆抗体,效价1:2000。建立受体夹心式ELISA法,可用来快速检测鱼类生长激素含量。4.构建了穿梭表达载体 pGAPZA-GH 用于胞内表达、pGAPZB-α-GH 用于分泌表达,电转化毕赤酵母(Pichia pastoris)后,获得整合有草鱼生长激素基因的克隆菌株,筛选获得能够胞内和分泌表达可溶的具有生物学活性的草鱼生长激素的高产菌株,连续50代培养,菌株表达稳定。建立了在5L自动发酵罐中发酵的主要技术参数,优化了培养基组分,生长激素的表达效率显著的提高,为工业发酵罐发酵积累了基本数据。5.含有重组 gcGH的酵母粗蛋白作为饵料添加剂(4ugGH/g 饵料)投喂黄河鲤鱼,实验组体重的增加显著高于对照组,平均增重在 16%-53%; 以未裂解的富集生长激素的酵母菌(4ugGH/g 饵料)作为饵料添加剂,投喂鲫鱼和罗非鱼,鲫鱼和罗非鱼的实验组和对照组的生长速度不存在显著差异;纯化生长激素浸泡黄河鲤鱼,两周后,实验组的生长显著高于对照组,持续饲养,实验组与对照组的生长不再存在显著差异。6.生长实验结束时,解剖观察生长加速的黄河鲤鱼,鱼体各脏器形态正常,内脏指数无显著差异,背部肌肉含水量无显著差异,蛋白含量显著高于对照鱼。对鱼体生化组成进行分析,结果表明:实验鱼的干物质含量显著高于对照鱼,干物质中的蛋白含量显著高于对照鱼,脂肪含量显著低于对照鱼。本研究利用化学合成草鱼生长激素cDNA,在大肠杆菌中获得草鱼生长激素的高效表达,首次实现了生长激素在毕赤酵母中的组成型表达。在此基础上,建立了快速检测重组草鱼生长激素活性的受体夹心式ELISA法。在5升自动发酵罐中,建立了转生长激素酵母高效表达的发酵参数。初步建立了重组草鱼生长激素作用鱼体的有效模式,证实了富集生长激素的毕赤酵母作为饵料添加剂不仅能促进鱼体生长而且可提高鱼体蛋白含量,重组草鱼生长激素在集约化水产养殖中具有重要的应用前景。
Pages116
Language中文
Document Type学位论文
Identifierhttp://ir.ihb.ac.cn/handle/342005/12600
Collection学位论文
Recommended Citation
GB/T 7714
王伟. 人工合成草鱼生长激素cDNA在大肠杆菌和酵母系统中的表达[D]. 中国科学院水生生物研究所. 中国科学院水生生物研究所,2001.
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