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题名: 微囊藻毒素的毒理学研究
作者: 李效宇
答辩日期: 2001
导师: 刘永定
专业: 水生生物学
授予单位: 中国科学院水生生物研究所
授予地点: 中国科学院水生生物研究所
学位: 博士
摘要: 微囊藻毒素(Microcystins,MC)是一类主要由铜绿微囊藻(Microcystsisaeruginosa)产生的单环七肽肝毒素。近年来,由于水体日趋严重的富营养化而加剧了微囊藻水华的频繁发生,如我国云南滇池、太湖、巢湖等每年都有不同程度的微囊藻水华发生。由产毒微囊藻所引发的野生动物、家畜、和家禽中毒、死亡的报道越来越多;同时,由有毒水华微囊藻或微囊藻毒素所引发的肝炎、肝癌及其它中毒事件也有一些报道。微囊藻毒素直接或间接地威胁着人类的健康,有必要深入研究其毒理学。 本文主要研究微囊藻毒素对几种淡水水生生物的毒性及其机理。通过分离、培养发现,云南滇池水华的微囊藻主要种类是铜绿微囊藻(Microcystsis aeruginosa)、惠氏微囊藻(M wesenbergii)和绿色微囊藻(M viridis),其中常以铜绿微囊藻和惠氏微囊藻占优势。用MA培养基可以在实验室大量培养三种微囊藻,藻生长良好(生长曲线为S型),通气条件下一周即可达到生长的平台期。采用改进的微囊藻毒素提取、制备方法可获得一定纯度的MC。经HPLC分析,MC-LR的含量为70.1μg/mg粗毒素,MC-YR为1.01 μ g/mg粗毒素。用有毒的微囊藻(M. aeruginosaPCC7806)喂养澳洲水泡螺(Bulinus australinanus),观察螺的生长状况后发现:螺可以取食微囊藻,但不能消化或只能部分消化。微囊藻严重影响螺生长、繁殖,长期喂食微囊藻会使螺因饥饿或染病而死亡。因此,微囊藻不能作为螺的单一食物。微囊藻毒素对螺的急性和亚急性毒性实验结果表明,螺对微囊藻毒素有很强的耐受力,毒性试验过程中未发现微囊藻对螺的致死情况。微囊藻毒素对泥鳅(Misguruns anguillicaudatus Gunthe)胚胎、仔鱼和幼鱼的毒性实验结果揭示,MC对胚胎有强烈的致畸效应,这种效应是剂量依赖型的并具有胚胎发育的阶段敏感性特点。MC在卵刚受精后处理,致畸效应的半数有效浓度,EC_(50) = 244.6μg/L,卵裂期处理为138.9 μ g/L,胚孔封闭期为166μg/L,仔鱼为164.3μg/L 。泥鳅胚胎不同发育时期对MC的敏感性不同,顺序为卵裂期 > 仔鱼期 > 原肠胚 > 受精卵。 MC致畸的主要症状是:心包水肿,管状心脏形成,心动过缓或血流停止;孵化延迟,孵化异常;卵黄吸收差,卵黄崩解;弯体、弯尾,大头或小头;仔鱼无运动能力或运动能力差等。TEM结果表明,MC主要造成肝细胞的细胞膜、细胞核、内质网等细胞器的损伤,也造成心肌细胞和红细胞的损害。另外,MC对幼鱼有较强的致死效应(LC_(50) = 593.3 μg/L),幼鱼对MC的敏感性低于胚胎发育期。在淡水鱼类胚胎发育不同时期用MC 处理,研究MC的胚胎发育毒性(包括MC的致畸作用和致死作用研究等),并从超微结构方面揭示MC致畸作用和致死作用的原因,国内外尚属首次报道。用不同浓度MC-LR(0,10~(-3),10~(-2),10~(-1),1,10,10~2,10~3,10~4μg/L)处理鲤鱼(Cyprinnus carpio)、鲫鱼(carassius linnaeas)和鲢鱼(Hypothalmichthy molitricx)肝细胞培养物,细胞出现了典型的细胞凋亡(Apoptosis)特征。如肝细胞细胞膜发泡(Blebbing)、肝细胞染色体DNA Ladder的出现和细胞核的形态变化等。说明MC-LR诱导了这三种淡水鱼肝细胞的凋亡,但这种作用是剂量依赖型的。高浓度毒素能导致培养的肝细胞坏死(Necrosis),低浓度无影响或影响不明显,适当浓度的毒素才能诱导肝细胞凋亡(1,10,100ug/L的MC-LR暴露),最低有效浓度为1μg/L。用MC-LR诱导培养的淡水鱼类肝细胞凋亡在国内外未见类似的报道。用50μg/L和500μg/L的MC-LR处理鲤鱼肝细胞培养物,观察研究MC-LR对肝细胞的毒性效应。结果发现,50μg/L的MC-LR引起培养的肝细胞膜发泡,但细胞膜不破裂;而500μg/L的MC-LR导致肝细胞膜破裂,细胞崩解。同样,50μg/L的MC-LR引起培养的肝细胞核固缩、靠近细胞膜、变形,但细胞核不碎裂;500μg/L的MC-LR导致细胞核碎裂、弥散。培养的肝细胞内质网在50 μg/L的MC-LR作用下,发生膨胀,并管泡化,形成同心圆圈,但此浓度下线粒体不受影响;500μg/L的MC-LR作用时,内质网破裂、线粒体肿胀、崩解为空心泡。另外,50μg/L的MC-LR会导致培养的肝细胞骨架膨胀、空间结构重排,但不破解;500μg/L的MC-LR则将细胞骨架破坏,引起细胞骨架崩解、碎裂。该实验结果表明,50μg/L和500μg/L的MC-LR引起培养的鲤鱼肝细胞两种不同的死亡方式,即凋亡和坏死。MC-LR引起肝细胞凋亡的机理可能是,MC-LR被肝细胞膜上的胆汁酸转运蛋白转运入细胞质内,迅速抑制肝细胞质的PP1/PP2A活性,打破了细胞磷酸化/脱磷酸化平衡,造成了细胞骨架蛋白的过磷酸化。而细胞骨架蛋白的过磷酸化引起细胞骨架重排的损伤,这种损伤导致了细胞膜发泡,直至凋亡。通过对鲤鱼肝细胞培养物抗氧化防御系统的几项指标测定发现,用10μg/LMC-LR处理肝细胞6hr后,ROS含量明显上升,升高达原含量的3倍左右;GSH含量此时下降3倍多;而初级防御系统的两种主要去除ROS的酶-SOD和CAT活性均明显升高;GSH-Px活性在MC-LR处理的初期(1hr)也有明显升高,但GST活性基本无变化。这一结果说明,MC-LR的毒害引起肝细胞的氧化应激,GSH、SOD、CAT和GSH-Px参与了肝细胞内氧自由基的去除,以消除MC-LR所造成的氧化应激损害。本实验研究了培养的鲤鱼肝细胞抗氧化系统的六项主要指标对MC-LR毒害的反应,从生物化学(氧自由基生物学)的角度解释MC-LR对鲤鱼肝细胞毒害的机理,国内外属首次报道。根据本论文的实验结果并参考相关的研究报道,笔者认为,MC造成培养的鱼肝细胞损伤、诱导细胞凋亡的机制是:MC-LR处理后,被肝细胞膜上的胆汁酸转运蛋白转运到细胞质内,首先抑制了细胞质PPl/PP2A的活性,相应激活了PKC活性,打破了细胞内磷酸化的平衡。这导致了细胞内许多功能蛋白的过磷酸化,造成了肝细胞的细胞骨架蛋白过磷酸化,而细胞骨架蛋白的过磷酸化引起细胞骨架空间结构的重排,这种损伤导致了细胞膜发泡,直至产生细胞凋亡。同时,由于MC-LR造成了肝细胞内磷酸化调节的失衡(已知细胞内磷酸化平衡的调节是细胞内信号转导调节的枢纽)促进了细胞质内Ca~(2+)信号的过量释放,进一步放大了这种损伤效应,加速了肝细胞凋亡的过程。另一方面,MC-LR的毒害诱发了肝细胞内的ROS含量过量上升,使肝细胞处于氧化应激状态。肝细胞V抗氧化初级防御系统迅速作出反应,GSH、SOD、CAT和GSH-Px参与了ROS的去除,以消除或减轻ROS对肝细胞的毒害。这些反应造成了肝细胞内的GSH含量急剧减少以至耗竭,从而使肝细胞抗氧化防御体系功能减弱或丧失原来的功能。过量的ROS会导致肝细胞的脂质过氧化、巯基状态改变及酶活性的抑制,加之肝细胞的磷酸化平衡和细胞信号转导功能的失调,使肝细胞膜通透性和结构发生改变,内质网等细胞内膜系统受损,肝细胞的细胞骨架结构重排和细胞核损伤,引发细胞膜发泡,并由此导致了细胞凋亡。
英文摘要: Microcystins are monocyclic heptapeptides produced by some species of freshwater cyanobacteria, primarily Microcystis aeruginosa. It has been reported that they can potently inhibit protein phosphatases typel and type2A in rat liver, inducing liver disease and even promoting liver cancer. Recently, toxic Microcystis blooms frequently occur in the eutrophic Dianchi Lake (300km~2 and located in the southwestern of China, Yunnan) and other lakes, for example, Taihu Lake and Caohu Lake. There are many reports that these toxic blooms are very harmful to animals and human beings. The toxicology of microcystins from Microcystis in Dianchi Lake was studied in this paper.
语种: 中文
内容类型: 学位论文
URI标识: http://ir.ihb.ac.cn/handle/342005/12588
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微囊藻毒素的毒理学研究.李效宇[d].中国科学院水生生物研究所,2001.20-25
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