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圆形碘孢虫抗原性及与宿主相互作用研究
章晋勇
Subtype博士
Thesis Advisor汪建国
2006-06-11
Degree Grantor中国科学院水生生物研究所
Place of Conferral水生生物研究所
Keyword圆形碘孢虫 异育银鲫 流行病学 抗原 单链抗体 噬菌体展示 抗体库
Abstract圆形碘孢虫是一种典型的形成孢囊的组织寄生粘体动物,本文以此为研究对象在重新描述的基础上对其孢囊季节动态、抗原性及其与宿主相互作用等三方面进行了研究,主要结果如下。 圆形碘孢虫是近年来危害异育银鲫养殖的常见病源之一,其寄生往往导致商品鱼出现可怕的外观而失去商品价值,主要寄生于鳃弓、咽部、吻部、颌部、鳃盖、背鳍、胸鳍、腹鳍、臀鳍、尾鳍、皮肤及肠壁等部位的上皮细胞膜。对武汉市陈家湖地区一异育银鲫养殖场的调查发现,其感染率及丰度均呈明显的季节性,当年8月份首次出现孢囊,最大感染率出现在冬季;孢囊大小随着虫体的不断发育至次年1月份达最大值;感染率及丰度均与水温呈负相关。其后孢囊逐渐脱落,至次年5月脱落完全,孢囊的脱落与水温不相关,更可能是其生活史发展的必然结果。另外,该粘体动物的感染表现出对宿主体长的选择性,孢囊只发现于体长大于10cm的宿主,但对宿主性别无明显偏向。 摸索了圆形碘孢虫全孢子ELISA检测模式的可行性,发现2%多聚甲醛和0.25%的戊二醛有较好的固定效果,最低可检出10个左右的完整成熟孢子,为比较粘体动物各种之间壳瓣的抗原差异及筛选抗孢子表面抗原的抗体奠定了基础。 利用噬菌体抗体库技术成功建立了抗圆形碘孢虫孢子可溶性蛋白、抗成熟完整孢子表面抗原、抗孢囊膜及前孢子期抗原及抗孢囊周围宿主组织抗原四个平行单链抗体库,库容分别为1.28×105,1.69×105,1.71×105,1.56×105;交叉检测发现,孢囊周围宿主组织与前三组分抗原表位重叠度较低,而它们三者之间却有较强的交叉反应,说明圆形碘孢虫孢囊膜可能并不是来源于宿主分泌的物质,而更可能是其自身为保护发育过程的胚体而出现的结构。通过生物淘选的方法筛选、鉴定了其中几株亲和力较高的抗体。pCAN-6H、pCAN-7J能特异性与圆形碘孢虫成熟孢子可溶性蛋白反应,识别的抗原大小分别约为34KD和21KD, 分别对应圆形碘孢虫孢子质蛋白和极丝蛋白。pCAN-3K所识别的抗原物质分布于孢子表面,包括壳瓣和缝脊,尤其是缝脊开口部,而不与孢子内部结构包括极囊和孢子质发生反应, 抗原分子量大小在17.6KD至107KD之间。pCAN-9A能特异识别孢囊内膜抗原,对应抗原大小介于17.2KD到91KD,说明圆形碘孢虫包囊内外膜的异质性,而这种异质性可能是组织寄生粘体动物的共性。pCAN-3F不仅能识别圆形碘孢虫前孢子期阶段抗原,还能和成熟孢子极囊发生反应,说明孢子发育过程中存在保守抗原,对应抗原大小约为40KD。错配PCR是体外提高抗体亲和力的有效途径,所得单链抗体能在原核表达系统中稳定高效表达。 圆形碘孢虫的感染并未造成对宿主生长的明显限制。8、9、10月采集的感染鱼较同池健康鱼非特异性免疫反应高,其它月份无显著差异。天然感染宿主血清中未发现抗成熟孢子的特异性抗体。圆形碘孢虫成熟孢子具有免疫原性及免疫刺激作用,免疫后15天,异育银鲫血清中出现特异性抗体,非特异性免疫参数均显著提升。感染鱼和健康鱼头肾吞噬细胞均表现出对成熟孢子的吞噬能力,吞噬活性不受抗血清及补体的调节,可能是由碳水化合物-凝集素介导的。孢囊由内、中、外三层结构组成,外层为结缔组织,与宿主的上皮组织相连,中间层为一透明基质,内层为一单层柱状上皮细胞层,孢囊外围未见明显炎症反应,主要器官如鳃、肝脏、脾脏及肾脏亦未出现明显病理变化。
Pages174
Language中文
Document Type学位论文
Identifierhttp://ir.ihb.ac.cn/handle/342005/12132
Collection学位论文
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GB/T 7714
章晋勇. 圆形碘孢虫抗原性及与宿主相互作用研究[D]. 水生生物研究所. 中国科学院水生生物研究所,2006.
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