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题名: 应用噬菌体展示技术对对虾白斑综合症病毒(WSSV)中和抗体及感染相关蛋白的研究
作者: 袁丽
答辩日期: 2006-06-17
导师: 戴和平
授予单位: 中国科学院水生生物研究所
授予地点: 水生生物研究所
学位: 博士
关键词: 对虾白斑综合症病毒 (WSSV) ; 噬菌体展示 ; 中和抗体 ; 单链抗体 (scFv) ; 荧光定量PCR ; 原代细胞培养 ; 模拟抗原表位 ; 体外淘选 ; 体内淘选 ; 病毒感染相关蛋白
摘要: 对虾白斑综合症自1992年爆发以来,以其传播速度快,致死率高的特点,对全世界各国的对虾养殖业造成了严重的威胁。引起该病的病原体——对虾白斑综合症病毒 (WSSV),在分类学上已经被鉴定为一个新的病毒家族中的新种,其结构非常复杂,对其感染宿主的分子机理的研究难以借鉴已知病毒的研究结果。而且对虾细胞系尚未成功建立,这对WSSV中和抗体的筛选及感染相关蛋白的研究带来了困难。为此,本研究应用噬菌体展示技术对WSSV的中和抗体及感染相关蛋白进行了研究。 本研究以对虾淋巴原代细胞培养为基础,建立了一种高通量体外筛选中和抗体的方法。应用该方法对本实验室已获得的抗WSSV的单链抗体进行筛选,得到了一个能够阻止WSSV与对虾淋巴原代培养细胞结合的单链抗体P1D3。活体中和实验也证实该单链抗体具有一定的中和作用。由于单链抗体是在大肠杆菌中表达和制备的,能够低成本,快速地进行无限扩增,因此该单链抗体有望发展成一种具有抗病毒能力的对虾饲料添加剂。 为了完善上述已建的立体外筛选中和抗体的方法,本实验还建立了一种新的荧光定量PCR方法,对WSSV病毒粒子进行定量分析,并将该方法应用到体外筛选中和抗体的方法中。实验证明纯化的WSSV病毒悬液不需要提取DNA而可以直接作为FQ-PCR的模板进行扩增,并且能准确测定模板DNA的拷贝数,从而使该体外中和抗体筛选方法操作更为方便,也更为准确。 为研究单链抗体P1D3对应于WSSV上的抗原模拟表位,本研究以pCANTAB 5 E噬菌粒为载体,构建了较高容量的噬菌体展示随机十肽库,并用一种已知抗原的能与WSSV特异性结合的单链抗体A1对噬菌体展示随机肽库进行淘选,得到了一系列的阳性多肽序列。根据这些阳性多肽的氨基酸序列相似性比对分析,对单链抗体A1的抗原模拟表位做出了预测。随后对单链抗体P1D3也进行了相同的研究,得到了大量的阳性多肽序列,但是尚未成功得到P1D3的抗原模拟表位,这部分研究工作有待进一步深入。 本研究还优化了对活体对虾进行体内淘选和器官体外淘选的方法,并对T7噬菌体展示的WSSV cDNA文库进行了淘选,以期获得能与对虾相关器官上的细胞受体相互作用的WSSV定向靶蛋白,从而获取该病毒的感染相关基因。经过数轮的体内淘选和器官体外淘选已获得一些阳性克隆,这些阳性克隆蛋白是否确定是WSSV感染相关蛋白有待进一步的克隆和鉴定。
语种: 中文
内容类型: 学位论文
URI标识: http://ir.ihb.ac.cn/handle/342005/12126
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应用噬菌体展示技术对对虾白斑综合症病毒(WSSV)中和抗体及感染相关蛋白的研究.袁丽[d].中国科学院水生生物研究所,2006.20-25
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