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题名: 鲤鱼(Cyprinus carpio)促性腺激素的纯化及其α亚基新转录本的发现
作者: 王蕴
答辩日期: 2006-06-14
导师: 朱作言 ; 胡炜
授予单位: 中国科学院水生生物研究所
授予地点: 水生生物研究所
学位: 硕士
关键词: 鲤鱼(Cyprinus carpio) ; 促性腺激素 ; 基因克隆 ; 基因表达 ; 多克隆抗体 ; 蛋白纯化 ; 选择性剪接 ; 转录本 ; 信号肽
摘要: 促性腺激素(Gonadotropin Hormone,GtH)是由脊椎动物垂体前叶细胞合成与分泌的一类糖蛋白激素,主要生理作用是刺激生殖细胞的生长、发育、成熟、排精及排卵。鱼类中也存在两种典型的GtHs,即GtHI 和 GtHII,分别对应于哺乳类的卵泡刺激素(Follicle-Stimulating Hormone, FSH)和促黄体生成素(Luteinizing Hormone, LH)。GtH是一个二聚体分子, 由一个共同的α亚基和一个具有激素生物学特异性的β亚基组成,只有两个亚基结合在一起才能发挥激素的生物学活性。硬骨鱼的生殖发育虽然受很多因素的影响,但由垂体前叶细胞和性腺介质细胞(follicle cell)分泌的GtH在性腺发育和性成熟中起主要调控作用。 鲤鱼(common carp, Cyprinus carpio)是我国常见的经济淡水鱼, 也是常用于研究淡水鱼类内分泌调控的模式鱼。本研究室从上世纪80年代开始转基因鱼研究,目前已经研制成功了快速生长的转全鱼生长激素基因黄河鲤家系。通过转入生长激素基因,使该特定功能基因与基因组表达产物协调作用使鱼的生长速度加快从而缩短了生长周期。然而激素的调控是一个复杂的网络系统,一种激素的改变可能会引起另一种激素的变化。本实验室最近发现,转全鱼生长激素基因鲤鱼的第一次性成熟时间明显晚于对照鱼(本实验室待发表资料)。因此,转全鱼生长激素基因鲤鱼除具备优良养殖性状外,还有可能成为一种独特的模型,在鱼类内分泌学研究领域发挥作用。在硬骨鱼类,下丘脑合成的促性腺激素释放激素(Gonadotropin-releasing hormone, GnRH)直接通过神经轴突末梢作用于垂体前叶的促性腺激素细胞,与膜上分布的受体结合后刺激垂体合成的释放促性腺激素(Gonadotropin Hormone,GtH),进而激活性类固醇激素的生成,调节性腺发育和最后的性成熟,即性腺发育与性成熟的整个过程受下丘脑-垂体-性腺轴(hypothalamic-pituitary-Gonad, HPG)这个完整而协调的神经内分泌系统调控。本文就与性腺发育关系最密切的激素--促性腺激素,也是下丘脑-垂体-性腺轴的中间信号分子进行了以下方面的研究: 1. 采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,从鲤鱼脑垂体获得GtHα和两种GtHβ亚基的cDNA,克隆到pMD18-T载体。经测序确证后,将这三个基因克隆到原核表达载体pET-32(a)中,转化E.coli表达菌BL21(DE3),以IPTG诱导融合蛋白的高效表达。利用初步纯化后的重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。应用制备的兔抗血清与抽提的鲤鱼脑垂体的总蛋白分别进行Western-blot及ELISA分析,结果显示获得的多抗能特异识别各自的天然蛋白。免疫荧光实验也证实了制备的三种多克隆抗体能与垂体和卵泡相应的天然抗原结合。 2. 采用传统的、以填料为核心的柱层析技术对鲤鱼脑垂体的总蛋白进行了分离纯化。利用本实验室已有的GH单抗和本论文制备的GtH各亚基的多抗对纯化得到的蛋白组分进行了鉴定,结果表明得到了满足需要的相应蛋白,为制备促性腺激素的单克隆抗体,进而建立一个ELISA检测系统,迅捷、便利地测定鲤鱼生长发育过程中血清里的GtHI和GtHII含量奠定了基础。对于尚未鉴定的蛋白组分,正在进行质谱和N段测序分析,已经拿到的部分结果显示我们成功得到了乳酸脱氢酶α亚基、催乳素、β-血红素蛋白以及生长-催泌乳素(Somatolactin-SL),另外还有部分样品正在进行分析中,有望为研究鱼类体内激素的网络调控特征研究,以及开展鱼类脑垂体蛋白质组研究提供有益的启示。 3. 采用RT-PCR方法克隆GtH亚基的过程中,发现了鲤鱼(Cyprinus Carpio)促性腺激素α亚基的一个新转录本。该转录本只有291nt(命名为GtH-α291),与GtH -α357(NCBI Number: X56497)分析比较表明,它是由第二个外显子丢失66bp形成的,属于GtH-α357的一种选择性剪接。以卵巢RNA为模板进行RT-PCR,发现卵巢里也存在这种新转录本。经过 SignalP server分析发现,选择性剪切的66nt正好编码GtH-α357的信号肽。在Hela细胞中进行GtH-α291和GtH-α357的表达,发现GtH -α291的确不能分泌到细胞外。进一步的免疫共沉淀实验发现,该转录本既能和GtHI β亚基结合,也能和GtHII β亚基发生相互作用。推测其功能可能与正常有功能活性的α亚基竞争结合β亚基,从而对能分泌到胞外的GtH在量上起调节作用,鲤鱼在不同的发育时期GtHI和GtHII含量水平不同可能与此相关。这是第一次在GtHα亚基中发现存在选择性剪接现象,而且,这种由于选择性剪接导致信号肽丢失,进而影响蛋白量的调控方式尚未见报道。 总之,本研究成功地克隆了鲤鱼促性腺激素(GtH)基因,在此基础上,进行了GtH基因的原核表达及多克隆抗体制备,并从鲤鱼脑垂体中纯化获得天然的GtH蛋白,同时,分离纯化了鲤鱼垂体里的其它几种蛋白,为研究鱼类激素的网络调控和开展鲤鱼脑垂体蛋白质组研究奠定了基础。本研究还首次发现了GtHα亚基mRNA的选择性剪接方式,研究表明该新转录本编码的蛋白缺失信号肽而不能分泌到胞外,推测其功能可能与正常有功能活性的α亚基竞争结合β亚基,从而对能分泌到胞外的GtH在量上起调节作用,这种由于选择性剪接导致信号肽丢失,进而影响蛋白量的调控方式尚未见报道。
语种: 中文
内容类型: 学位论文
URI标识: http://ir.ihb.ac.cn/handle/342005/12080
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鲤鱼(Cyprinus carpio)促性腺激素的纯化及其α亚基新转录本的发现.王蕴[d].中国科学院水生生物研究所,2006.20-25
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