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牙鲆eIF2α激酶基因HRI和PKR的克隆、表达及功能分析
朱蓉
Subtype博士
Thesis Advisor桂建芳
2006-06-11
Degree Grantor中国科学院水生生物研究所
Place of Conferral水生生物研究所
KeywordEif2α激酶 血红素调节抑制因子(hri) Dsrna依赖的蛋白激酶(pkr) 草鱼出血病病毒(gchv) 大菱鲆弹状病毒(smrv) 牙鲆囊胚培养细胞(fec) 诱导表达 功能分析 抗病毒反应 翻译抑制
Abstract当真核细胞面临各种外界压力时,可通过磷酸化真核翻译起始因子eIF2α的Ser51位点来调节蛋白的合成。目前发现了四种磷酸化eIF2α的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,分别是HRI(the heme-regulated initiation factor 2α kinase)、PKR(the interferon inducible double-stranded RNA dependent protein kinase)、GCN2(the general control nonderepressible 2)和PERK(the endoplasmic reticulum-resident kinase)。本研究通过构建紫外灭活的草鱼出血病病毒(grass carp hemorrhage virus, GCHV)诱导的牙鲆囊胚培养细胞(flounder (Paralichthys olivaceus) embryonic cells,FEC)的SMART cDNA文库,运用同源克隆法,成功克隆鉴定了牙鲆的两个eIF2α激酶基因PoHRI(Paralichthys olivaceus HRI)和PoPKR,表达特征和初步功能分析揭示PoHRI和PoPKR在牙鲆的抗病毒免疫反应中可能发挥翻译抑制功能。 PoHRI是成功克隆的第一个鱼类HRI基因,全长cDNA序列为2391bp,编码651aa。结构上,PoHRI与已知HRI蛋白具有高度同源性,C端包含12个保守的eIF2α激酶催化亚区,IV和V区之间有一段长136aa的激酶间区,并具有相对保守的N端区域(NTD)。体外诱导研究表明,热休克、病毒感染和PolyI:C都能诱导FEC细胞中的PoHRI mRNA的上调表达,但不同压力下PoHRI的表达模式不同。原核表达特异于PoHRI的N端1-200氨基酸的融合多肽,免疫小鼠成功获得抗PoHRI抗体血清,western blot分析揭示不同压力下PoHRI蛋白呈现与mRNA一致的上调表达模式。体内研究证明PoHRI在牙鲆组织中是一种遍在表达的激酶,可能不仅仅是一种血红素依赖的eIF2α激酶。人工感染大菱鲆弹状病毒(scophthalmus maximus rhabdovirus,SMRV)发现PoHRI在牙鲆相应组织的表达明显上调。PoHRI的病毒诱导特征暗示其可能在抗病毒免疫反应中发挥蛋白翻译抑制或某种未知功能。 PoPKR全长cDNA序列为2596bp,编码688aa。推导的PoPKR蛋白具有哺乳类PKR的保守结构域,包括N端的两个dsRNA结合区(dsRNA-binding motifs,dsRBMs),dsRBM1和dsRBM2,以及C端由12个保守的催化亚区组成的激酶区。在IV区和V区之间有一个由23aa组成的激酶间区。此外,哺乳动物PKR的两个肝素结合区(heparin-binding domain)ATD和CTD在PoPKR中也能找到。进化分析表明PoPKR与先前鉴定的鲫鱼PKR-like(其N端具有两个Zα结构域)在结构上有显著不同,是鱼类中鉴定的第一个哺乳类PKR的直向同源基因。 对PoPKR的功能进行了初步分析。PolyI:C pull down证实PoPKR的dsRBM1和dsRBM2具有结合dsRNA能力。通过转染野生型PKR和突变体PKR(Lys420突变为Arg420,缺失dsRBMs),证实PoPKR具有蛋白翻译抑制功能,这种抑制翻译的功能主要由C端激酶催化区决定。由于灭活GCHV、SMRV和PolyI:C都能诱导FEC细胞中PoPKR的上调表达,而且在SMRV感染的过程中,PKR的表达上调伴随着eIF2α的磷酸化上调。因此,PoPKR可能与哺乳动物PKR一样,在牙鲆细胞的抗病毒免疫反应中能被dsRNA激活,发挥抑制蛋白合成的功能。 鉴于首次发现HRI也是一种病毒诱导上调的eIF2α激酶,进一步比较PoPKR和PoHRI的诱导表达特征发现,不管是灭活GCHV、SMRV和PolyI:C诱导,还是在SMRV感染的牙鲆组织中,PoPKR的表达上调显著高于PoHRI。据此推测,如果在抗病毒免疫反应中PoHRI也发挥翻译抑制的功能,PoPKR应该发挥主导作用。
Pages143
Language中文
Document Type学位论文
Identifierhttp://ir.ihb.ac.cn/handle/342005/12020
Collection学位论文
Recommended Citation
GB/T 7714
朱蓉. 牙鲆eIF2α激酶基因HRI和PKR的克隆、表达及功能分析[D]. 水生生物研究所. 中国科学院水生生物研究所,2006.
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