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题名: 微卫星DNA及ISSR技术在原生动物中的应用研究
作者: 张文静
答辩日期: 2006-06-13
导师: 余育和 ; 沈韫芬
专业: 水生生物学
授予单位: 中国科学院水生生物研究所
授予地点: 水生生物研究所
学位: 博士
关键词: 原生动物 ; 微卫星DNA ; ISSR技术 ; 遗传关系 ; 遗传多样性
摘要: 首次把微卫星DNA以及相关的ISSR (inter simple sequence repeat) 技术引入自由生活原生动物分子生物学领域。 一、对原生动物微卫星引物特异性和适用性进行了研究,采用寄生种类克氏锥虫的8个微卫星引物在4种自由生活的原生动物基因组上进行PCR 扩增,取8条300-500bp扩增条带进行回收、克隆和测序。但测序结果所有种类都未得到相应微卫星DNA序列, 表明在同一目以及更高分类单元扩不出相应的微卫星位点, 原生动物微卫星引物特异性高。 二、运用探针杂交的方法从基因组中筛选微卫星位点。将随机引物分别对嗜热四膜虫和小眼虫进行随机多态DNA(RAPD, Random Amplification of Polymorphic DNA)扩增,建立部分基因组库,并通过Southern杂交和原位杂交,选择阳性核酸带测序。从70个RAPD体系中,独立筛选和鉴定8个微卫星位点序列,并估计了它们在基因组中的丰度。这是在自由生活原生动物中筛选微卫星的首次报道。研究表明: 1)与哺乳动物相同,在这两种原生动物的基因组中CT重复显著多于GT重复;2)四膜虫总DNA中微卫星GT,CT重复的丰度显著小于小眼虫,并进一步探讨了原因可能是纤毛虫大核DNA的特性所致;3)发现大量的单核苷酸多聚A和T,推测是在逆转录转座时产生。进而,运用ISSR技术对某些纤毛虫进行了遗传关系和种群遗传学的研究。 一、用13个ISSR引物对五株纤毛虫进行扩增,六个ISSR引物获得多态性片段。根据Nei氏遗传距离矩阵构建了五株纤毛虫的遗传关系树状图。UPGMA, NJ聚类图表明:两株嗜热四膜虫最先聚在一起;其次是褶累枝虫和多态喇叭虫聚在一起,然后再与嗜热四膜虫聚在一起;咽膜亚纲的绿草履虫形成独立的一枝。结果显示:1)缘毛亚纲纤毛虫可能是寡膜纲中较独特的一个类群,建议提升缘毛亚纲纤毛虫的分类地位;2)缘毛亚纲褶累枝虫与膜口亚纲嗜热四膜虫的亲缘关系近于咽膜亚纲绿草履虫,在寡膜纲中绿草履虫处于原始地位;3)五株纤毛虫基因组中均含有微卫星DNA序列:(GTG)4、(GACA)4、(AG)8、(CAA)6和(GAA)6。 二、在五种缘毛类纤毛虫中进行遗传关系的ISSR研究,由UPGMA, NJ聚类图显示:伞形钟虫首先分离出来;螅状独缩虫和金龟累枝虫聚在一起。对比由核糖体小亚基 RNA基因序列构建的系统发育树,发现:1) 螅状独缩虫与累枝虫的关系近于伞形钟虫。在缘毛类纤毛虫分类中,单生或群居是重要的系统发育特征;2) 褶累枝虫和瓶累枝虫的关系近于金龟累枝虫。在累枝虫属纤毛虫中,柄的中空与否是一个有用的系统发育和分类特征。本研究表明ISSR方法在纤毛虫相近和相似种遗传关系研究中是一种新的有用的方法。 三、从34个ISSR引物中筛选了8个引物,分别对采自东湖、南湖、沙湖和菱角湖的48株螅状独缩虫进行了遗传多样性分析。共得到81条带,其中76条呈现多态,多态百分率为93.83%。Nei’s 基因多样性和Shannon氏信息指数也表明螅状独缩虫遗传多样性高。同时,发现了一定的基因流。推测遗传多样性高的原因是频繁的接合生殖和游泳体的广泛传播。分子方差分析表明种群间遗传变异低。聚类分析和主成分分析表明来自同一个湖泊的样品通常聚在一起。经相关分析和Mantel检验,Nei’s 遗传距离与地理距离只呈现弱的正相关,阐明空间隔离在这个区域螅状独缩虫种群分化中起到一定的作用。
语种: 中文
内容类型: 学位论文
URI标识: http://ir.ihb.ac.cn/handle/342005/12000
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微卫星DNA及ISSR技术在原生动物中的应用研究.张文静[d].中国科学院水生生物研究所,2006.20-25
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