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题名: 蛙虹彩病毒(RGV)的复制与宿主细胞骨架及超微组织变化
作者: 黄晓红
答辩日期: 2006-06-19
导师: 张奇亚
授予单位: 中国科学院水生生物研究所
授予地点: 水生生物研究所
学位: 博士
关键词: RGV ; 蛙虹彩病毒 ; 病毒装配区 ; 免疫电镜 ; 细胞骨架 ; 线粒体
摘要: RGV(Rana grylio virus)是从我国患病的美国青蛙中分离到的一种蛙虹彩病毒。超微观察表明,RGV装配是在胞质内的病毒装配区(viromatrix)中进行的。我们利用电镜技术、免疫学技术、流式细胞技术及分子生物学等技术方法,对RGV的复制与宿主细胞骨架及超微组织变化等进行了研究。主要结果如下: 1. 在RGV感染的不同时间,通过电镜观察对鲤鱼上皮瘤(epithelipma papulosum cyprini,EPC)细胞内病毒装配区进行了定性和定量的分析。在感染6 h的细胞内,近核区域观察到病毒装配区。该区域的电子密度比周围胞质相比较浅,不含有细胞器(如线粒体、细胞骨架等)。在装配区内,观察到不同形态的病毒装配中间体和一些无定形结构:管状物和膜样物质。管状物直径约110-124nm,它的一端和病毒空心衣壳相连。膜样物质由三层膜组成,它的一端和病毒装配中间体相连。此外,在装配区内,还观察到一些致密絮状物质和直径约40-50nm小管等。 共观察了990个细胞用于病毒装配区的定量分析。结果表明,394个细胞中含有装配区,其中89.3%含有一个,10.7%含有两个以上。装配区的数目从感染 6 h逐步增加直至16 h达到最大值。装配区的面积在感染24 h时增加到7.4± 0.69μm2,约是感染6 h时的三倍。病毒装配区内空心衣壳的数目总大于完整的病毒粒子数目,并且两者之间有明显的正相关。 2. 为进一步确定无定形结构与病毒装配的关系,利用免疫电镜技术,对RGV感染的EPC细胞进行了观察。比较不同固定液、脱水条件、包埋剂、抗体浓度及染色液对样品观察的效果,选择优化组合。用4%多聚甲醛-0.25%戊二醛混合固定液固定感染细胞,酒精完全脱水,LR White包埋样品制备超薄切片;再以提纯RGV为抗原制备的兔抗血清(1:40)为一抗,直径10nm羊抗兔IgG-胶体金(1:50)为二抗,免疫染色后进行超微观察。结果表明,病毒装配阶段,胶体金颗粒主要结合于病毒粒子的衣壳上;而在病毒成熟释放阶段, 通过出芽进入到胞质小泡或释放到胞外的病毒粒子囊膜上有胶体金信号。除了病毒粒子外,与病毒装配相关的结构上也都有胶体金强信号,如病毒装配区内的致密团块絮状物质上、膜样结构和管状物的外层膜上。但在正常胞器上没有观察到明显的标记。 3. 采取免疫荧光显微镜和电镜观察,空斑测定法,对RGV宿主细胞内微管形态的时序变化及微管在病毒释放中的作用进行了研究。观察结果显示,感染10 h,RGV感染引起微管形态发生明显的变化:从微管组织中心伸出的微管弯曲变形,微管网状结构紊乱;部分微管在微管组织中心聚集。感染15 h时,弯曲的微管聚集后形成环形结构,同时伴随细胞变圆和脱落。感染20 h时,变圆的细胞内观察到很少的微管;部分细胞膜被破坏,大量病毒粒子从破裂处释放到胞外。微管形态发生改变是RGV引起细胞病变的原因之一。用抗有丝分裂试剂,秋水仙素处理感染细胞,空斑法测定病毒滴度。在不同感染阶段,比较秋水仙素对RGV产量影响,结果推测微管对病毒释放有很重要作用。 此外,利用丙稀酰胺和EGTA分别作为中等纤维和微丝的破坏试剂。超微观察结果显示,未处理的感染细胞内,成束的中等纤维位于病毒装配区外围。在一些感染细胞内,晶格样排列的附近也观察到中等纤维束。在感染晚期,细胞表面伸出一些含有微丝束的突起。在丙稀酰胺处理的感染细胞内,观察到几种不同形态的装配区。EGTA处理感染细胞后,细胞表面突起的数目减少,多数病毒粒子聚集在质膜下方。空斑测定结果表明,两种试剂处理均导致病毒产量明显下降,推测中等纤维和微丝参与了RGV感染。 4.利用红色荧光蛋白作为线粒体的标记信号,通过荧光显微镜观察了RGV感染的肥头鲤(Fathead minnow, FHM)细胞内线粒体分布的变化。同时结合电镜技术、流式细胞技术、以及其它理化方法,对线粒体超微结构、线粒体膜电位、线粒体呼吸和细胞内caspase-3活性进行了研究。在病毒感染晚期,多数线粒体在病毒装配区周围分布。秋水仙素处理感染细胞后,仅有少量线粒体位于装配区周围。感染细胞内,线粒体形状多样、直径缩小;线粒体内的嵴稀疏甚至消失,嵴内隙加宽;线粒体的数目增加。病毒感染影响了线粒体膜电位(Δψm)和线粒体呼吸。感染早期,线粒体Δψm轻微增加,随着感染时间延迟,线粒体Δψm逐渐下降。线粒体呼吸的变化趋势和Δψm的变化在感染时序上是一致的。此外,RGV感染细胞内caspase-3的活性增强。推测RGV通过影响线粒体Δψm来调节线粒体呼吸和产生ATP的能力,caspase-3的活性增强可能也和线粒体Δψm下降有关。
语种: 中文
内容类型: 学位论文
URI标识: http://ir.ihb.ac.cn/handle/342005/11980
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蛙虹彩病毒(RGV)的复制与宿主细胞骨架及超微组织变化.黄晓红[d].中国科学院水生生物研究所,2006.20-25
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