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鳗鲡病原菌的分类鉴定及相关免疫基础研究
郭松林
Subtype博士
Thesis Advisor关瑞章
2006-06-09
Degree Grantor中国科学院水生生物研究所
Place of Conferral水生生物研究所
Keyword鳗鲡 病原菌 分类鉴定 免疫组化定位 抗菌肽 交叉抗原 淋巴细胞转化试验
Abstract鳗鲡是我国最重要的养殖经济鱼类之一,目前我国主要养殖种类为欧洲鳗鲡(Anguilla anguilla)、日本鳗鲡(Anguilla japonica)以及少量的美洲鳗鲡(Anguilla rostrata),在养殖过程中,细菌性疾病是养殖鳗鲡尤其是欧洲鳗鲡的主要病害。但是,目前对鳗鲡病原菌的分类鉴定和防治还缺乏有效的方法。本论文主要研究了鳗鲡病原菌的分类鉴定及相关的免疫基础。在病原菌的分类鉴定方面,我们以患病鳗鲡的肝脏为主,分离细菌并研究其致病性,结合细菌的形态、生理生化和分子生物学特征建立了鳗鲡病原菌的分类鉴定方法。在相关免疫基础研究方面,探讨了病原菌人工感染鳗鲡后,其在鳗鲡不同脏器内的定位和由此引起的组织病理学变化,同时对病原菌感染后,鳗鲡血清中蛋白质的变化及其抗菌活性进行了测定。本论文还研究了鳗鲡主要病原菌外膜蛋白成分间的交叉抗原,探讨了最佳的鳗鲡淋巴细胞转化条件。主要研究内容及结果如下: 1. 从福建部分地区发病鳗鲡脏器中共分离到116株细菌,经初步鉴定,筛选了其中的44株菌用于人工感染试验。结果表明22株细菌的毒力较强,其中病原菌阴沟肠杆菌和梅氏弧菌国内外均未见报道。 2. 经染色处理后,采用光学和电子显微镜观察了20株病原菌的形态,初步研究了这些细菌的菌落和菌体特征,并建立了有参考价值的分类标准。根据菌落大小可分为微小型(直径<0.5mm,)、小型(0.5mm<直径<1mm)、中型(1mm<直径<2mm)、大型(直径>2mm)四类菌落。分离的鳗鲡病原菌主要为无芽孢革兰氏阴性细菌。据鞭毛染色特征可分为无鞭毛,周生多鞭和端生单鞭三类。据菌体的长短轴之比值可分为球状(1-1.1)、短杆状(1.2-2.5)和长杆状(>2.5)三类。 3. 从鳗鲡分离的病原菌主要是弧菌科细菌。本文参考伯杰氏细菌鉴定手册的生理生化指标对弧菌科细菌进行了鉴定,同时与弧菌科快速检测试剂盒的鉴定结果进行了比较,采用纸片法药物敏感试验进行了辅助鉴定。结果表明,除2株细菌不能鉴定到种外,其余14株病原菌可被鉴定为嗜水气单胞菌、温和气单胞菌和海鱼弧菌3个菌种。抗生素敏感试验结果表明,生理生化指标相同的细菌对抗生素敏感性相似,但指标存在差异时鉴定为同种的病原菌对一些抗生素的敏感性也存在差异。这14株菌中有12株菌采用伯杰氏手册鉴定与试剂盒鉴定结果相同。 4. 本研究应用PCR法扩增病原菌的16S rDNA片段并进行序列分析。在细菌生化鉴定的基础上,我们选择了16株鱼类病原菌(其中13株从鳗鲡分离)进行研究,探讨该方法鉴定未知菌的可行性。结果表明,这些细菌经16S rDNA片段序列分析后可分为气单胞菌属、假单胞菌属和肠道菌属等三个属,同属间的细菌16S rDNA片段序列相似性大于97%,而不同属细菌的16S rDNA片段序列相似性小于90%。16株细菌中的12株16S rDNA序列分析结果与生化鉴定结果相同。本研究结果表明,较为简便经济的16S rDNA片段序列分析可替代全长序列分析方法和生化鉴定方法用于初步鉴定未知菌。 5.本研究拟建立一种快速的嗜水气单胞菌检测方法。据该菌编码的溶血素(Hemolysin)和外膜蛋白(Ompts)基因设计了两对引物进行扩增。结果表明,32株被检测细菌中,5株既有溶血素基因又有外膜蛋白基因的细菌均为嗜水气单胞菌,13株仅具有外膜蛋白基因的细菌中有5株为嗜水气单胞菌,表明双重PCR法可用于快速检测同时具有两个基因的嗜水气单胞菌。 6. 以6.7×105cfu/g剂量的嗜水气单胞菌感染鳗鲡后探讨其在鳗鲡脏器内的定位和由此引起的组织病理学变化。结果表明三个时期(6h,24h和48h)的临床症状和病理变化相同。肾脏组织病理变化较肝脏,肠道和鳃部明显,主要表现为肾小管上皮细胞肿胀和肾小球坏死脱落。肝脏损伤表现为严重充血,肠道和鳃部病理变化不明显。免疫组化研究结果表明,感染的细菌主要分布在鳗鲡肾脏内,其它三个脏器中较少。 7. 本试验采用健康鳗鲡分别注射病原菌和生理盐水后对欧洲鳗鲡血清中的抗菌肽进行了研究。结果表明,注射嗜水气单胞菌后在分子量为6kD和20kD处存在差异蛋白,注射鳗鲡爱德华氏菌后在分子量为14kD和20kD处存在差异蛋白,其中6kD处的差异蛋白被证实有抑制嗜水气单胞菌生长的活性。 8. 研究了16株鳗鲡病原菌间的交叉抗原。结果发现,8种被检免疫血清中有5种免疫血清与1-6株细菌存在明显的交叉反应;1种血清与7株细菌存在明显的交叉反应。提取这7株细菌的外膜蛋白,并确定了它们的交叉抗原成分,从而为其后的免疫原性研究准备了基础。 9.动物的细胞免疫水平通常采用淋巴细胞转化试验进行检测。本研究对该转化试验的培养温度(15.0-30.0℃)、培养时间(42-90h)、ConA (0 -30μg/ml)、小牛血清(0-15%)和鳗鲡血清(0-15%)浓度五个重要参数进行了优化。结果表明,鳗鲡淋巴细胞于20.0℃、含10μg/ml ConA, 10%鳗鲡血清和10%小牛血清的RPMI1640细胞培养液中培养90h后可获得最好的转化效果。
Pages180
Language中文
Document Type学位论文
Identifierhttp://ir.ihb.ac.cn/handle/342005/11932
Collection学位论文
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GB/T 7714
郭松林. 鳗鲡病原菌的分类鉴定及相关免疫基础研究[D]. 水生生物研究所. 中国科学院水生生物研究所,2006.
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